肝炎病毒基因工程抗体的研究

　　钟彦伟，成 军，王 刚，洪 源，陈菊梅

　　钟彦伟，成 军，王 刚，洪 源，陈菊梅，中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心 北京市 100039

　　项目负责人 钟彦伟，100039，北京市，中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心

　　收稿日期 2002-01-15 接受日期 2002-02-05

　　钟彦伟，成军, 王刚, 洪源, 陈菊梅. 肝炎病毒基因工程抗体的研究.世界华 人消化杂志 2002;10(2):219-221

　　0 引言

　　乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎分别是由乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感 染引起的世界性传染病［1-10］. HBV、HCV感染不仅引起急性、慢性病毒性肝炎， 而且与肝硬化和肝细胞癌的发生和发展密切相关［11-20］. 流行病学调查表明, HB V感染的阳性率为10%，抗-HCV的阳性率为3.2%，对我国人民健康危害极大. 因此，急需研究有效的针对乙型、丙型病毒性肝炎的防治措施. 其中肝炎病毒人源化基因工程抗体及其应 用是目前的主要研究方向之一.

　　1 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒基因工程抗体的研究背景

　　目前在我国引起慢性病毒性肝炎的肝炎病毒类型主要是HBV和HCV. 乙肝疫苗应用后 ，HBV感染率显著下降. 但是还有许多现症患者需要探索新型治疗方法. 作为引起慢性肝病 的HCV的研究还有很多问题亟待解决，HCV的疫苗也因为HCV病毒的准种特点以及抗原位点的 高度变异而举步维艰. 抗HBV、HCV感染的治疗，目前除了部分患者对重组干扰素、拉米夫定 有一定的治疗反应外，还没有更为确切的抗病毒治疗方法. 1975年杂交瘤技术的建立，使得 单克隆抗体广泛应用于临床治疗与研究的各个领域. 在病毒性肝炎治疗研究方面，关于HBV 、HCV特异性人源化抗体的研究，探索这些抗体在HBV、HCV感染诊断和治疗中的应用也引起 了广泛重视.

　　从抗体研究的历史来看，抗体分子的研究过程可以分成3个阶段. 第一阶段就是第一代抗体 分子的研究，主要是含有多克隆抗体的抗血清，包括动物源和人源的抗血清，含有不同抗体 分子的混合物的血液制品. 在过去特定的历史阶段，这种抗体对于免疫学科的发展和人类抵 御传染病的侵袭发挥了重要而广泛的作用. 第一阶段经过了相当长的历史. 直到1975年，德 国和英国的科学家建立了小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤的技术，为源源不断产 生抗体分子提供了细胞物质基础. 通过这一途径，结合杂交瘤细胞的有限稀释和免疫筛选技 术，可以获得分泌单一抗体分子的所谓的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所分泌的抗体分子是均一的、识别单一抗原表位的抗体分子. 这种抗体分子较第一代的多克隆抗体具有较强的特 异性，因此，一经发现就在免疫学检测方面得到了广泛的应用. 近年来，随着抗体分子遗传学机制的研究，以及基因操作技术和噬菌体表面展示技术的不断成熟，抗体基因的扩增、文库的构建、噬菌体表面展示技术的结合，即形成了抗体的基因工程技术.

　　2 HBV、HCV基因工程抗体的研究现状

　　单克隆抗体的特异性较多克隆抗体有显著的提高，因此在免疫检测方面得到了广泛的应用. 但是，杂交瘤分泌的单克隆抗体从其蛋白质性质和来源方面，还是属于小鼠的蛋白质. 小鼠来源的蛋白质应用于体外的免疫学诊断不涉及其抗原性的问题，但是，如果应用单克隆抗体进行免疫治疗和体内的免疫学显像时就有很大的困难. 因此，前些年不少科学家探索了人-人杂交瘤细胞系的建立、应用分子生物学技术构建人-鼠嵌合型抗体分子等技术途径，因为稳定性差和其他方面的原因，一直没有取得显著的进展. 自从进入20世纪80年代，随着抗体基因工程技术的建立，才在人源化基因工程抗体研究方面取得突破. 人源化基因工程抗体筛选、鉴定、表达、纯化、应用等技术的不断发展和成熟，对于抗体分子的研究以及人类体内应用抗体的研究起到了极大的推动作用. 噬菌体表面展示技术，体现了抗体基因工程的最新研究技术手段，他将外源蛋白基因通过与丝状噬菌体外壳蛋白基因融合而将外源蛋白表达在丝状噬菌体颗粒的表面，该技术将表型和基因型联系在一起，将识别相应抗原和进行再扩增的能力结合起来，不经人体免疫，绕过杂交瘤，仅仅通过几轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选富集过程，即可得到人源化的基因工程抗体［21-34］. 目前关于HBV、HCV抗体的研究领域中，人源化单链可变区抗体的噬菌体表面展示技术是用于 体内的较为先进的抗体研究技术方案. 由于多克隆的抗血清中含有多种抗体成分，因而不具 备特异性. 分泌单克隆抗体的杂交瘤技术，虽然解决了抗血清所不具备的抗体的特异性问题，但作为鼠源性的蛋白，在体内应用时不可避免地会引起免疫排斥反应. 因此，只有基因工程抗体的技术才能将抗体的人源化问题和抗体的特异性问题一并解决.抗体的噬菌体表面展示技术可以避开杂交瘤细胞系建立和筛选、鉴定的烦琐技术过程，制备分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系是一种技术繁杂、周期长、耗时耗力的技术过程. 基因工程抗体的噬菌体表面展示技术则相对简单、周期短、效率较高. 因为只是体外表达基因工程抗体噬菌体的“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程，因此比杂交瘤细胞系技术更为简便、周期短、 成本低. 特异性抗体编码基因克隆化的实现，加上基因工程技术的不断成熟，将体外应用基 因工程技术获得具有抗原结合活性的特异性抗体成为可能. 通过噬菌体表面展示技术筛选得 到的抗体基因，可以直接构建真核、原核、酵母等细胞的表达载体，利用现代基因工程技术大量表达基因工程抗体，为人源化基因工程抗体技术的广泛应用提供了可能性. 关于HCV基因工程抗体的研究，近年来国外Zhai et al［35］和Chan et al［36] 报道了HCV E2的基因工程抗体的筛选研究结果，Songsivilai et al［37］报 告了HCV核心蛋白的筛选结果，国内北京解放军第302医院基因治疗研究中心报道了一系列HB V、HCV人源化基因工程抗体筛选、鉴定、表达及在肝活检组织的免疫组织化学检测中的应用 研究结果，证实了HBV、HCV人源化基因工程抗体具有特异性和实用性［21-34］.

　　3 肝炎病毒基因工程抗体的应用

　　关于人源化基因工程抗体的研究，最大的优势就是体内应用的问题. 因为只有发展到人源化 基因工程抗体阶段，才能应用抗体进行体内诊断和治疗的研究. 这种体内应用的途径可以分 为体外表达重组抗体蛋白，作为一种药物应用，也可以将人源化单链可变区抗体的基因与抗 HBV、HCV治疗性蛋白的编码基因融合，表达靶向HBV、HCV的药物；另外一种应用途径就是基 因治疗. 可以采用基因治疗的技术，将编码抗体的基因，重组到基因治疗表达载体中，利用 基因治疗的技术手段，将抗体的编码基因导入到体内进行表达，体内表达的抗体分子，与相 应的HBV、HCV抗原结合，阻断HBV、HCV复制、表达、装配和出细胞芽生过程，从而达到抗HB V、HCV基因治疗的目的. 这是其他类型的抗体研究所不能达到的. 第三种用途是应用上述表达、纯化的基因工程抗体作为特异性抗体，进行慢性HBV、HCV感染者肝活检组织中相应HBV、HCV抗原的免疫组织化学检测，证实慢性HBV、HCV感染患者的肝活检组织中具有相应的HBV、HCV抗原的表达，这也是基因工程抗体的重要用途之一. 由于获得的基因工程抗体只包含了抗体基因的小片段，不包括Fc段，作为免疫组织化学的检测试剂，具有结合活性好、背景染色低的优点.

　　4 HBV、HCV人源化基因工程抗体推广应用的前景

　　乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒抗原特异性基因工程抗体的研究是探索新型的抗HBV、HCV治疗的重要手段. 第一，随着HCV发病的免疫机制研究的不断进展，必将阐明HCV的中和抗体的抗原表位. 因此，人源化抗体的研究，可以有望成为抗HBV、HCV治疗的有效手段. 第二，人源化基因工程抗体可以用于靶向药物的设计. 随着抗HBV、HCV药物研究的不断进展，特别是蛋白、多肽类和小分子化合物等的研究，人源化基因工程抗体与这些药物进行交联，或者编码抗HBV、HCV药物的基因与人源化基因工程抗体的基因直接融合，表达融合蛋白，也是设计新型靶向药物的重要途径. 第三，进行抗HBV、HCV治疗的细胞内免疫基因治疗. 利用基因治疗的基因转移和表达技术，将HBV、HCV的特异性抗体的编码基因，转移到细胞内进行表达，设计新型的抗HBV、HCV细胞内免疫的基因治疗方案，将本来不在细胞内表达，进入不到细胞内的抗体分子导入到细胞内表达，阻断HBV、HCV病毒的生活周期，达到基因治疗的目的. 第四，进行HBV、HCV抗独特型抗体基因疫苗的研制与应用. 目前，在肿瘤研究领域，以基因工程抗体形式的抗独特型抗体基因疫苗在治疗淋巴瘤方面已经取得了很大进展［38］. 如果HBV、HCV抗独特型抗体基因疫苗在肝炎治疗领域能够取得同样效果，必将对HBV、HCV的治疗产生积极影响.

　　5 参考文献（略）