肝炎病毒DNA疫苗的研究

　　洪 源，成 军

　　洪源，成军，中国人民解放军第302医院基因治疗研究中心北京市 100039

　　项目负责人 洪源，100039，北京市，中国人民解放军第302医院基因治疗研究中心

　　收稿日期 2002-01-15 接受日期 2002-02-05

　　洪源，成军. 肝炎病毒DNA疫苗的研究. 世界华人消化杂志 2002;10(2):221-222

　　0 引言

　　DNA疫苗就是将编码抗原的基因导入到体内，细胞内表达抗原，诱导特异性体液和细胞免疫 应答，进行预防和治疗疾病的一种分子生物学技术. 传统上用于预防病毒性肝炎的疫苗为血源性疫苗和近几年来发展的基因工程疫苗. 前者如未完全纯化，则有可能使接种者感染病毒性肝炎. 而后者工艺复杂，难度大，成本高，运输不便. 故而人们希望找到一种新的安全有 效、制造简便、廉价的疫苗.

　　1 DNA疫苗的研究背景

　　1990年，Wolff et al［1］试图用注射方法促使小鼠的肌细胞吸收DNA以产生新 的蛋白质. 设置的对照组在注射时未加任何化学佐剂，出人意料的是小鼠吸收了这种裸露的 DNA后，能高水平的表达外源蛋白. 1992年，美国德州大学西南医学中心医学和生物化学系 的Johnston小组［2］在Nature杂志报道了第一例DNA疫苗研究报告，他们将装载有人 生长激素（GH）和人α-1抗胰蛋白酶（AAT）编码序列的质粒注射小鼠，化验其血清产生了 相应的抗体. 1994年的世界卫生组织会议上将该项技术命名为DNA疫苗技术. 此后，DNA疫苗 技术在医学的各个领域蓬勃地发展起来了.

　　2 DNA疫苗的作用机制

　　DNA疫苗一般由病原体抗原编码基因和真核表达杂质粒构成. 通过皮下、肌肉注射或颗粒轰 击技术进行免疫，使目的基因在体内表达，从而诱导机体产生针对这种抗原的体液和细胞免 疫. 其激活免疫系统的主要原理［3,4］为：裸DNA进入体内后，被原位细胞所吞噬， 内源性表达靶蛋白，蛋白被分解为肽段，表位与β2-微球蛋白和主要组织相容性复合体（M HC）-I类分子形成3聚体，递呈并激活CD8+ T效应细胞（Te）；或靶蛋白通过血运和/或 淋巴循环系统汇集于局部淋巴结或脾脏中，为“专业”抗原提呈细胞（APC）所吞噬，经与M HC-II类分子结合，激活CD4+ T辅助细胞（Th），Th激活B效应细胞（Be）和B记忆细胞（Bm ），Be将在骨髓中形成生发中心，长期生成特异性抗体. Bm可诱导T记忆细胞（Tm）的产生，而Tm则作为潜在的细胞毒性T淋巴细胞（CTL），保存在循环库中. 因为DNA疫苗表达的蛋 白质可作为内源性抗原被递呈，故他具有传统疫苗所不具备的优势. 即：能够有效地诱导机 体细胞毒T淋巴细胞（CTL）的细胞免疫应答.

　　3 肝炎病毒DNA疫苗的研究进展

　　3.1 HBV DNA疫苗的研究进展 1993年Davis et al ［5］首次将HBV ayw亚型S基因的编码序列亚克隆到真核表达载体中，通过肌注小鼠 后发现抗-HBs逐步上升，并可见明显的量效关系.8wk后，100%的实验组表现为抗-HBs阳性 ，抗体水平均高于100mIU/ml. 1996年Davis et al［6］将核酸疫苗技术应用 于大猩猩体内进行实验研究，并取得良好效果. 该报道为第一篇灵长类动物HBV核酸疫苗的研究报道. 同年，Mancini et al［7］构建了真核重组质粒，可表达HBV（ayw）前S2和S基因，将其注射于HBV转基因小鼠体内. 之后发现接种DNA疫苗后，小鼠血清中HBsAg 含量明显下降，免疫后8wk，血清中HBsAg检测值近为零；免疫后12wk，肝脏中无法检测HBsA g mRNA. 接种后2wk血清中抗-HBs阳转，12wk时仍可检测为阳性，作者认为DNA疫苗可通过 其内源性抗原提呈系统激活CTL细胞活性，从而打破免疫耐受. 1997年，中国台北学者Chow et al［8］首次将IL-2应用于核酸疫苗的研究中. 他们将IL-2的编码序列直 接连接在HBV前S2/S基因之后（pS2-S-IL-2），或通过串联启动表达系统，在前S2/S 基因之后另有CMV启动子启动IL-2的表达（pS2-S/pIL-2）. 联用pS2-S与pS2-S-IL-2 或pS2-S/pIL-2之后，体液免疫的效果强于单用pS2-S组，持续时间长. 1998年，德国学 者Wild et al［9］应用双顺反子质粒表达系统进行了HBV核酸疫苗研究. 在CMV 启动子下游，接HBcAg编码序列，之后跟一内部核糖体进入位点（IRES），IRES下游为HBsAg 编码序列，命名为pCMV/C-S. 免疫小鼠后可检测到高水平的抗-HBs和抗-HBc. 1999年 ，美国的Tacket et al［10］报道了第一次将HBV核酸疫苗应用于人类志愿者的 一期临床实验研究结果.该研究应用基因枪（PowderJect XR1）将包裹于金微粒表面的DNA 疫苗质粒以高速注射入人体皮肤中，6名健康志愿者和1名HBV血清标志物阳性者分为3组， 共免疫2次，相隔56d. 结果在6名健康志愿者中，有1例经一次接种后就产生了持续高滴度的 抗-HBs应答，余5名均未见免疫应答. 后经分析回顾性资料，发现此例阳性反应者以前可能 暴露过H BV感染. 这一研究结果说明DNA疫苗可诱导很快的加强免疫反应. 但可能由于接种时质粒量、压力、基因枪系统等原因，最终的免疫效果不尽人意，还需进行进一步的研究. 对于HBV 核心抗原（HBcAg）DNA疫苗的研究，1997年Geissler et al［11］报道，以HBcA g DNA疫苗免疫的小鼠都产生了抗-HBc及强烈的HBcAg特异性CTL免疫应答. CTL应答的动力 学证实在第一次免疫后16-21d，CTL就已产生抗-HBc的细胞毒性溶解作用，且此CTL活性至 少可维持数月.

　　3.2 HCV DNA疫苗的研究进展 1995年，Tokushige e t al［12］将HCV核心区基因插入到真核表达载体中，命名为pHCV2-2. 免疫小鼠 后发现40%的小鼠出现抗HCV抗体. 特异性CTL功能检测结果表明，免疫组小鼠体内存在有特异而强有力的细胞免疫应答. Tedechi et al［13］针对HCV E2区是重要的中和抗体识别位点，构建了HCV E2区DNA疫苗. 免疫12只Balb/c小鼠后发现，10只出现抗HCV E2 抗体. 1997年，Saito et al［14］对HCV DNA疫苗进行了较为系统的研究. 他们 分别构建了HCV C、E1、E2、E1E2、CE1E1及去除高变区的E2HVR DNA疫苗，结果发现上述DNA 疫苗均可诱导特异性体液免疫应答，但只有C区DNA疫苗能诱导特异性的细胞免疫应答. 这种 特异性的CTL免疫应答对预防不同株型的HCV感染具有重要意义，并认为HCV核心区存在主要 的抗原决定簇，因此能诱导强烈的CTL细胞免疫应答. 为了解决HCV E2区高变问题，2001年Z ucchelli et al［15］运用噬菌体展示技术构建了E2高变区（HVR1）的模拟表 位，并以DNA形式进行了免疫. 结果证明，所有11个DNA疫苗均可刺激小鼠或家兔产生抗HVR 1抗体，其中5个可与HVR1天然变异发生交叉反应. 进一步将这些DNA疫苗混合免疫，可 有效地提高交叉反应率. 虽然目前众多的实验表明，HCV DNA疫苗在小鼠体内可诱导强烈的 免疫应答，但由于缺乏理想的HCV动物模型，其免疫保护作用难以判断.

　　4 DNA疫苗面临的挑战及展望

　　DNA疫苗的研究近年来发展迅速，日益显示出其巨大的潜力和应用前景. 但是，他的历史毕 竟很短，还有许多问题急需解决：①安全性：尽管现有的动物实验研究未发现任何副作用， 但仍有必要进一步研究以探明外源DNA是否与宿主染色体整合.②DNA接种的免疫学机制仍待 深入研究. ③接种途径、接种方式及诱导效率有待进一步提高.

　　5 参考文献

　　1 Wolff JA, Malone RW, Williams P. Direct gene transfer into mouse musc le in vivo. Science 1990;247:1465-1468

　　2 Tang D, Devit M, Johnston SA. Genetic immunization is a simple method for eli citing an immune response. Nature 1992;356:152-154

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　　4 Whitton JL, Rodriguez F, Zhang J. DNA immunization: mechanistic studies. Va ccine 1997;17:1612-1619

　　5 Davis HL, Michel ML, Whalen RG. DNA-based immunization induces continuous se cretion of hepatitis B surface antigen and high

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　　6 Davis HL, McCluskie ML, Gerin JL. DNA vaccine for hepatitis B: evidence for i mmunogenicity in chimpanzees and comparison with

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　　7 Mancini M, Hadchouel M, Davis HL. DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen

　　 chronic carrier state. Proc Nat l Acad Sci USA 1996;93:12496-12501

　　8 Chow YH, Huang WL, Chi WK. Improvement of hepatitis B virus DNA vaccines by p lasmids coexpressing hepatitis B surface antigen

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　　9 Wild J, Gruner B, Metzger K. Polyvalent vaccination against hepatitis B surface and core antigen using a dicistronic expression plasmid.

　　 Vaccine 1 998;16:353-360

　　10 Tacket CO, Roy MJ, Widera G. Phage 1 safety and immune respons e studies of a DNA vaccine encoding hepatitis B surface antigen

　　 delivered by a g ene delivery device. Vaccine 1999;17:2826-2829

　　11 Geissler M, Tokushige K, Chante CC, Zurawski VR Jr, Wands JR. Cellular and humoral immune response to hepatitis B virus structural

　　 proteins in mice af ter DNA-based immunization. Gastroenterology 1997;112:1307-1320

　　12 Tokushige K, Wakati T, Pachuk C. Immunoresponse to plasmid DNA encoding the hepatitis C virus protein.

　　 J Virol 1995;69:2684-2693

　　13 Tedechi V, Akatsuka T, Shih WK. A speific antibody response to HCV E2 elicited in mice by intramuscular inoculation of plasmid

　　 DNA containing coding s equence for E2. Hepatology 1997;25:459-466

　　14 Saito K, Sherman GJ, Kurokohchi K. Plasmid DNA-based immunization for haatitis C virus structural proteins: Immune responses

　　 in mice. Gastroenterol ogy 1997;112:1321-1329

　　15 Zucchelli S, Roccasecca R, Meola A, Ercole BB, Tafi R, Dubuisson J. Mi motopes of the hepatitis C virus hypervariable region 1, but

　　 not the natural seq uences, induce cross-reactive antibody response by genetic immunization. Hepa tology 2001;33:692-703