慢性病毒性肝炎发病机制的分子生物学研究

　　成军，中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心 北京市 100039

　　成军，男，博士.现任解放军第302医院副主任医师，军医进修学院副教授、硕士学位研究生导师，解放军传染病研究所副所长，基因治疗研究中心主任，中华医学会热带病与寄生虫病学会全国常委兼秘书，《中华传染病杂志》编委.已出版《肿瘤相关基因》（2000）等4部专著，发表综述及论文200篇.主要从事病毒性肝炎的临床医疗工作以及传染病相关的基因克隆化、基因治疗与基因疫苗的研究.

　　国家自然科学基金资助课题，No. C39970674，No. C03011402，军队“九、五”科技攻关项，No. 98D063，军队回国留学人员启动基金项目，No. 98H038

　　项目负责人 成军，100039，北京市丰台路26号，中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心. cj@genetherapy.com.cn www.genetherapy.com.cn

　　电话: 010-66933391 传真: 010-63801283

　　收稿日期 2002-01-15 接受日期 2002-02-05

　　摘 要

　　由乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的感染引起的急性和慢性肝病目前还没有满意的治疗方法.新型治疗方法和治疗药物的研究开发，依赖于肝炎病毒致病的分子生物学机制的研究进展.关于HBV感染个体准种概念的引入，使我们对于HBV基因变异的研究，从单一病毒的基因变异上升到群体病毒的基因变异、从静态的基因突变上升到动态的基因变异，从 而对HBV存在状态的看法发生了根本的改变.HBV感染肝细胞的相关受体蛋白虽然进行了多年的研究，但还没有最终确定.利用新型技术对于HBV表面抗原蛋白的结合蛋白进行筛选是一个 重要的方向.HBV和HCV感染与肝细胞癌之间的关系已经得到确定，但是具体的分子生物学机 制还有许多工作要做.研究这2种肝炎病毒反式激活作用的把基因是阐明其引起肝细胞癌分子生物学机制的重要途径.在肝细胞中表达的肝炎病毒蛋白不是孤立存在的，或者与其自身结 合形成同二聚体，或者与病毒的其他蛋白、肝细胞蛋白结合形成异二聚体，从而对于肝细胞 的生长、代谢、甚至是恶性转化产生重要影响.

　　成军. 慢性病毒性肝炎发病机制的分子生物学研究进展.世界华人消化杂志 2002; 10(2):125-128

　　0 引言

　　乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的感染，不仅引起急、慢性病毒性肝炎，而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关［1-7］. 但是，目前除了部分患者对于 干扰素α（IFNα），或部分慢性乙型肝炎患者对于核苷类似物拉米夫定的治疗有部分应答 之外，还缺乏确切有效的治疗方法［8-12］. 除了拉米夫定以外，几种新型的核苷 类似物正在进行临床试验之中. 关于丙型病毒性肝炎的自然史还没有完全阐明. 慢性乙型肝 炎患者血清中存在准种（quasispecies）特点，也是严重影响抗HBV治疗效果的重要因素. 关于慢性病毒性肝炎的发病机制，如肝炎病毒特异性的受体、HBV DNA整合的机制及 其后果、肝炎病毒蛋白与肝细胞蛋白之间的相互作用、HBV/HCV的RNA/DNA的结合蛋白、 肝炎病毒蛋白的反式激活作用等，还有许多环节没有阐明，所有这些都是慢性病毒性肝炎发 病机制分子生物学的重要内容，其研究进展的相对滞后，严重影响慢性病毒性肝炎抗病毒治 疗新型治疗方案的探索.

　　1 乙型肝炎病毒基因的异质性与准种特点

　　不同的慢性乙型肝炎患者血清中HBV基因序列是不同的, 因为HBV存在不同的基因型（genoty pe）和血清型（serotype）. 但同一个患者血清中的HBV基因序列的状态如何,可能不同的人 有不同的答案. HBV感染个体在相对较短的时间内，HBV基因的突变造成基因序列有微小差别 的种群, 一般不会超过核苷酸总长度的2～5%，这种差别不构成病原体不同的基因型或血清 型，但的确存在着基因序列的差别，这种现象称为准种［13-17］.我们的研究表明，在慢性HBV感染患者中，的确存在准种现象，同时也得到了文献［18，19 ］的证实. 从2例患者的血清中扩增S基因（包括前-S1、前-S2和S区）, 分别获得了29和2 8个克隆. 当以EcoRI/*!XhoI进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析时，在每一例患者中至少发现5种以上的表现形式，这种RFLP特点经核苷酸序列的测定得到证实. 对于所得到的克隆进行序列分析，结果表明每个克隆之间的序列不完全一样，但同源性在98%以 上，遗传学上高度相关［20-24］. 随后对HBV其他的结构基因区如X基因、核心基因、逆转录酶区等以及调节基因区如SP1、SP2、CP、XP和增强子基因序列的异质性进行研究， 都证实了HBV在慢性感染个体中都是普遍存在的，为慢性HBV感染者体内存在HBV DNA的准种 特点提供了直接的证据［25-29］.乙型肝炎病毒基因序列的异质性及准种有如下一些特点：第一，HBV基因序列的异质性和准 种特点是慢性HBV感染患者普遍存在的一种现象，而不是仅存在于个别患者的特点［30-34］. 第二，HBV基因序列的异质性和准种特点在HBV基因序列的结构基因区和调节基因 区都是普遍存在的. 在S、X、前-C/C、P基因区都存在基因序列的异质性和准种的特点， 而且在HBV基因的调节序列如启动子、增强子序列中都是存在的，这种特点贯穿于HBV整个基 因组［35-38］. 第三，HBV基因序列的异质性与准种的特点，具有重要的生物学和 临床意义. 由于HBV基因序列存在着异质性和准种的特点，产生具有反式激活和抗药性的突 变株，因而具有十分重要的生物学和临床医学意义. 第四，HBV基因序列的异质性和准种的 特点，将HBV基因序列的动态变化和种群的概念引入到了HBV的研究领域中. HBV基因突变始终都在进行之中，是一个动态变化的过程，由于HBV基因序列这种持续的变化，从而形成了 一系列的准种，这种突变的特点，不是指单一的病毒基因序列的改变，而是指HBV种群的漂 变（shift）.关于HBV基因的异质性和准种特点的研究，对于HBV生物学特性及临床研究都有十分重要的意 义. 因为在此之前对于HBV的研究，大多是以独立的HBV病毒株进行研究的，而很少将HBV当 成一个基因序列不均一的病毒群体进行审视. 引入群体的概念，替代个体的概念，同时，引 入优势种群的漂变，替代个体病毒基因序列的改变，使我们对HBV的认识更加深入、全面而合理. 首先，在HBV基因的异质性和准种的研究中，发现了HBV基因序列存在着各种不同类型 的基因突变，包括缺失突变、插入突变、碱基颠换突变、以及准种等多种类型. 第二，HBV 基因异质性与准种特点的研究，有助于对HBV DNA全基因序列的认识. 从研究方法上来说， 绝大部分都是分段克隆的，然后人工拼接完成HBV DNA的核苷酸全序列. 这只是一种人工拼 接的HBV DNA序列. 我们已经应用长距离多聚酶链反应（PCR）技术，从HBV慢性感染者血清 中获得了5株HBV DNA全基因序列. 这些HBV DNA的全基因序列已被GenBank收录（收录号为： AF363961，AF363962，AF363963，AF384371，AF384372）. 第三，HBV基因异质性与准种特 点的研究，有助于全面理解HBV基因突变的特点和规律. 关于HBV准种概念的引入，使我们对于HBV基因突变规律的认识，更加深刻而准确. 第四，HBV基因异质性与准种特点的研究，有 助于研究和了解HBV DNA准种形成的原因以及与临床表现和转归之间的相互关系，这是研究H BV DNA准种特点重要意义所在. 第五，HBV基因异质性与准种特点的研究，对于HBV防治研究 的未来将产生不可估量的影响. 因为在进行有效检测、有效免疫预防和有效抗病毒治疗之前 ，HBV感染在人群中的分布是相对随机和自然的. 但是，随着对于HBV检测、预防、治疗措施 的发展和应用，HBV感染的传播方式即已发生了根本的改变. 因为这种人为的干预和HBV准种 的随之漂变，目前流行的HBV感染病毒株特点与此之前的病毒种群相比较，已经发生了根本 的改变，并将继续发生变化. 因此可以想象，未来的某一天，到HBV种群的改变达到一定程 度，以往的检测手段不再有效，漏检率会大幅度提高，献血员的筛选不再有效，输血不再安 全；根据以前HBV流行株构建的基因工程疫苗的免疫预防覆盖率将会逐渐缩小，免疫预防不 再有效保护大部分易感人群；目前抗病毒治疗有效的药物筛选的结果，使抗药病毒株成为优 势种群，常规的抗病毒化疗药物不再有效. 那时，HBV感染的防治将会更加困难. 因 此，从现在开始就必须给予准种研究以充分的重视，否则，HBV感染的防治在不远的将来会 进入一个十分尴尬的境地.

　　2 乙型肝炎病毒前-S1蛋白结合蛋白的基因克隆化

　　乙型肝炎病毒表面抗原蛋白包括前-S1、前-S2和S蛋白, 是HBV结合肝细胞膜上特异性受体的主要蛋白成分, 但HBV特异性肝细胞受体目前还没有确定［39-42］. 研究表明, 前-S1蛋白在HBV结合与感染肝细胞的过程中具有十分重要的作用. 在HBV感染的肝细胞中,HBV的表面抗原包括前-S1蛋白组分与肝细胞蛋白能够结合, 形成异种蛋白复合物, 对于HBV 及肝细胞本身产生影响. 我们应用噬菌体表面展示(phage display)技术, 以固相化的前-S 1蛋白,对于含有肝细胞基因的噬菌体文库进行筛选, 获得了HBV前-S1蛋白的结合蛋白, 使 我们对于HBV表面抗原前-S1蛋白在慢性乙型肝炎的发病机制中的作用有了新的认识.实验中应用的前-S1蛋白是美国Virostat公司的产品，为大肠杆菌表达纯化的重组蛋白，经 固相包被以后，对含有肝细胞cDNA的噬菌体文库进行“吸附-洗脱-扩增”的3轮筛选， 对 于特异性结合前-S1蛋白的噬菌体中D的质粒DNA进行序列测定，获得了前-S1蛋白结合的肝 细胞蛋白的编码基因，即PBP1基因. PBP1蛋白由478个氨基酸残基组成. 利用生物信息学技 术, 对于我们所克隆的PBP1基因的同源序列进行分析搜索，结果证实我们的PBP1基因与GenB ank中的抑制胶质瘤侯选区基因2（GTSCRG2）(GenBank No. BC006311)的DNA序列完全同源. 但不能据此断定此基因的功能与肿瘤有关，因为在肿瘤相关基因区中含有另外的基因序列也 屡见不鲜. 关于PBP1/GTSCRG2的生物学功能目前正在研究之中.

　　3 肝炎病毒蛋白反式激活肝细胞靶基因的克隆化

　　肝炎病毒蛋白在肝细胞内不是孤立存在的，与肝炎病毒蛋白或者肝细胞蛋白结合成蛋白复合物，从而改变其生物学功能，这种蛋白-蛋白之间的相互作用是HCV感染慢性化以及引起感 染的肝细胞发生恶性转化的重要的分子生物学机制［43-49］. HCV的核心蛋白由191 个氨基酸残基组成，是一种具有多种生物学功能的病毒蛋白质，除了构成病毒的核壳结构以 外，在信号转导、细胞周期、正常细胞的恶性转化中具有十分重要的作用. 研究证实，HCV 核心蛋白通过激活癌基因H-ras和c-myc使正常细胞发生恶性转化，通过与淋巴毒 素-β受体（LTβR）的结合和作用造成HCV感染的慢性化. 为了进一步研究HCV核心蛋白的 生物学功能，我们应用抑制性消减杂交（SSH）技术结合生物信息学技术，对于HCV核心蛋白 结合的肝细胞蛋白的基因进行了克隆化研究.应用多聚酶链反应（PCR）技术扩增HCV核心蛋白编码基因，构建真核表达载体pcDNA3.1-c ore，转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，并以转染空白载体的相同细胞系作为对照.从2种转染的细胞系中提取mRNA，逆转录为cDNA，RsaI消化并连接接头，经过2次消减杂交和PCR扩增，将 产物克隆入T/A载体中，构建消减文库. 对于得到的233个克隆进行序列分析和生物信息学 分析，从中鉴定出4个未知功能基因是HCV核心蛋白反式激活的靶基因. 此外，还证实HCV核 心蛋白对于细胞周期调节基因WEE1具有表达上调作用，认为HCV核心蛋白的恶性转化作用可 能与其上调WEE1基因的表达有关. 但是事实是否如此，还需要有进一步的研究结果证实.乙型肝炎病毒的基因突变几乎包括了基因突变所有的类型. 提示HBV在其复制的DNA-RNA-D NA的过程中，由于存在着转录与逆转录的过程，HBV DNA聚合酶缺乏严密的校读功能，因而 存在基因变异. HBV DNA发生变异，一方面是HBV DNA复制过程中存在校读偏差，这是HBV DNA序列异质性存在的内因，其次HBV还要受到机体的免疫系统及抗病毒药物的选择压力等外因 的影响. 变异是绝对的，变异的程度和速度是相对的. 我们在HBV感染者的外周血中还发现 了具有反式激活功能的截短型表面抗原中蛋白（MHBst）缺失突变体的存在，这一点具有十分重要的生物医学意义［50］. 因为在此之前，关于具有反式激活功能的MHBst都是在HBV DNA阳性的肝细胞癌组织中发现的，而在外周血中发现MHBst是第一次，为慢性 HBV感染引起的肝细胞恶性转化的机制研究，提供了新的研究方向［51-52］. 我们 构建了MHBst的表达载体，体外转染实验表明对SV40早期即刻启动子具有反式激活作用， 利用SSH技术建立MHBst反式激活靶基因的消减文库，并证实这种HBV蛋白对原癌基因c- myc具有表达上调作用，而且以抗-c-myc的单克隆抗体进行Western blot杂交也证 实了MHBst对于c-myc的反式激活作用.在抗病毒治疗研究中，HBeAg的血清学转换是 取得应答的重要标志，但在抗-HBe阳性的患者中也存在相当比例的HBV DNA阳性者，以往都 以前-C区的基因突变进行解释. 但在我们的研究中发现前-S2区诱导中和抗体的基因区缺 失突变可能是抗-HBe抗体阳性患者清除HBV DNA不力的一个重要因素. 因此，关于前-S2区 基因突变的研究，丰富了对HBV基因突变与临床转归之间的相互关系的认识. 以往认为HBV X 基因是高度保守的，但是，对HBV X基因序列的异质性和准种特点的研究结果表明，HBV X基 因也具有准种特点，而且在其羧基末端还存在相对的高变区［53-58］. HBV X蛋白 对于HBV及异源性启动子具有反式激活作用，HBV X基因的异质性和准种特点对于其反式激活 作用具有显著的影响.

　　4 肝炎病毒蛋白结合的肝细胞蛋白基因的克隆化研究

　　肝炎病毒蛋白与肝细胞蛋白之间的结合及相互作用是病毒性肝炎发病分子生物学机制的重要 组成部分. 文献报道已经发现肝炎病毒蛋白可与一系列的肝细胞蛋白结合，并产生显著的生物学效应［59-62］. 为了阐明肝炎病毒蛋白与肝细胞蛋白之间的相互作用，发现 慢性病毒性肝炎发病机制研究的新线索，我们利用酵母双杂交技术对于肝炎病毒蛋白结合的 肝细胞蛋白的基因进行了克隆化研究. 首先将HCV核心蛋白的编码基因克隆到酵母表达载体p GBKT7，转化酵母细胞AH109并以Western blot杂交技术证实目的蛋白的表达. 将转化的AH10 9酵母细胞培养至109数量级，然后与含有肝细胞cDNA文库级的酵母细胞进行配合，然后在 缺陷型培养基中进行选择培养. 从能够生长的46克隆中提取质粒DNA进行序列分析，结合生 物学信息学技术手段，首次证实HCV核心蛋白与载脂蛋白A1能够结合，似乎可以解释HCV感染 引起肝脏脂肪变的分子生物学机制. 以我们的研究结果来看，结合其他作者发现HCV核心蛋 白与载脂蛋白A2能够结合，HCV包膜蛋白E1、E2与一系列不同的脂蛋白、载脂蛋白结合，可 以想象，HCV结构的内部或其结构表面，包裹着一层脂蛋白、载脂蛋白，这样就有理由相信H CV感染肝细胞，可能是经过肝细胞膜上的低密度脂蛋白受体（LDL-R）来介导的［63 -68］. 如此可以解释HCV进入到肝细胞的受体途径. 但这只是一种假说，还需要有进一 步实验研究结果的支持. 本项研究中同时发现HCV核心蛋白与染色体转位蛋白（translin） 能够结合，是否与HCV对于正常肝细胞的恶性转化作用有关，尚有待于进一步的研究证实［69,70］. 除了这些已知功能的基因之外，从本项研究中还发现了4个未知功能基因的 编码产物与HCV的核心蛋白能够进行结合，其生物学意义，以及与HCV核心蛋白结合以后在HCV慢性感染以及在HCV感染的肝细胞发生恶性转化的过程中所起的作用，还需要进一步的研究. 关于HBV、HCV各种结构和非结构蛋白结合的肝细胞蛋白类型、基因的克隆化、生物学意义的研究仍在进行之中.

　　5 参考文献（略）