乙肝致病机理及治疗药物研究再受关注

“第九届海内外生命科学论坛”在京隆重召开，与会专家强调：加强重要病毒性传染病基础研究刻不容缓。

乙肝病毒（HBV）在各种传染病中发病率居第2位，死亡率居第3位，乙肝已成为世界范围严重的公共卫生问题之一。浙江大学医学院李兰娟院士、武汉大学生命科学学院吴建国教授、军事医学科学院放射与辐射医学研究所王升启研究员在论坛上，分别围绕应用SELDI-TOFMS（表面增强激光解吸离子化飞行时间串联质谱）研究乙肝血清蛋白质指纹图谱的特点、探究乙肝病毒X蛋白（HBx）的致病机理和进行抗HBV药物的筛选报告了相关工作进展，使乙肝的防治研究再次成为研讨的焦点。

◆研究乙肝血清蛋白指纹图谱特点

蛋白质组学及其相关技术的发展，为研究重型肝炎及其并发症的发生机制、病理生理及生物标志物提供了新手段。SELDI-TOFMS是蛋白质组学领域出现的新技术，是蛋白质芯片技术与飞行时间质谱仪相结合的新平台，应用于传染性疾病的发病机制、诊断和防治等方面已取得了令人瞩目的成果。李兰娟院士领导研究小组通过该技术平台进行了乙肝患者血清蛋白质指纹图谱特点的研究。

肝脏是蛋白质合成和分解的重要器官，当肝脏因病毒感染发生炎症时，会引起患者体内血清蛋白质水平的变化。李兰娟院士等应用SELDI-TOF-MS技术检测了健康对照组和慢性乙肝患者血清中相对分子质量位于1000~10000之间的蛋白质指纹图谱，筛选两组图谱的44差异峰，应用因子分析方法处理这44个差异峰以及6个反应肝功能的经典指标（总胆红素、直接胆红素、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、凝血酶原时间转移酶及MELD分数），结果提示这些差异峰是胆红素微聚体及其类似物、凝血过程产生的片段以及其他分子。

随后，他们将其中的重型肝炎血清按预后不同分成死亡组与存活组，比较两组间的蛋白质指纹图谱。t检验结果提示，38个峰的强度在两组间存在显著差异。用主成分分析（PCA）方法处理数据，结果提示两组之间仅极少数样本重叠在一起。他们采用人工神经网络分类方法建立了重型肝炎预后预测模型，预测正确率达到85.7%；随后依据构建完成的神经网络模型，计算各差异峰相关连接权重占总权重的百分比，从而进一步判断各差异峰对预后的相对重要性，最终确定了5个权重最大、在预后模型中起最重要作用的蛋白质。

李兰娟院士表示，下一步的工作则是扩大样本量，不断验证和优化本研究的预测模型，同时更深入地研究这些与预后密切相关的蛋白质标志物。

◆探索HBx致病致癌的机理

吴建国教授指出，当前，HBV感染机制仍无定论，致细胞病变机理也尚不清楚。而探索乙肝病毒与细胞因子的相互作用及其功能研究是揭示HBV致病和致癌分子机理的基础，可为乙肝及相关疾病的防治提供依据。

他们的研究小组发现，HBx在肝癌细胞以及其他癌细胞系（Hela）中具有抑制细胞恶性转化的功能，而以鼠胚成纤维细胞（STO）为代表的正常细胞却具有促进细胞恶性转化的功能。研究还发现，用病毒基因HBx和肿瘤基因Ras共转染STO细胞能刺激细胞凋亡，而两者分别转染细胞时却无此功能。HBx或Ras能诱导裸鼠的肿瘤生长，但是HBx与Ras协同作用后却抑制肿瘤生长。通过进一步研究，他们提出了HBx作用的分子机制，即HBx作为肿瘤诱发因子，能刺激正常肝细胞的恶性转化，与激活的原癌基因Ras协同作用后，通过诱导FasL蛋白的表达，激活caspase-8，降低线粒体的跨膜电位差，促使线粒体释放细胞色素C，导致细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长。

此外，他们在研究HBV与炎症反应的相关性及其作用机制中发现，HBV能激活炎症因子COX-2的表达，说明HBV引起的炎症反应可能与COX-2的激活和表达相关。研究还证明，参与调控COX-2表达的病毒蛋白是HBx，HBx通过与转录因子C/EBP-β直接结合，来调控C/EBP-β与炎症因子COX-2基因启动子结合并激活COX-2基因的表达，从而引起细胞的炎症反应。

吴建国教授还透露，他们最近分离和鉴定了一种新的与HBx蛋白相互作用的细胞因子并将其命名为岳飞（YueF）。研究证实，YueF是一种新的肿瘤抑制因子，这为病毒学和肿瘤学等领域提供了新的重要信息。

◆筛选抗HBV药物的“宿主靶标”

HBV感染目前没有特效的防治方法，其主要问题是耐药，从而限制了靶向病毒的抗病毒药物的发展。病毒复制具有宿主依赖性，从宿主细胞中寻找抗病毒药物靶点由此成为抗病毒治疗的一个新策略。王升启研究员等的研究表明，Fn、A-SGPR、EREG、ABHD2可能成为治疗HBV感染的潜在“宿主靶标”；以其为靶点的反义寡核苷酸Fn1、AS2、E3、AB3以及小分子化合物0412有可能成为治疗HBV感染的先导化合物。这一结果为新型抗病毒药物的筛选奠定了基础。

王升启研究员具体介绍说，他们主要取得了三方面的进展：首先，他们筛选获得了30个在HepG2.2.15细胞中上调而在药物干预后表达发生下调的基因。在这30个基因中，Fibronectin、ASGPR1、Aromatise、SPR1、ABHD2等在HepG2.2.15细胞中特异性表达，而在药物干预后表达显著下调。生物信息学功能分析发现，Fibronectin、ASGPR1、ABHD2、EREG等可能成为新的HBV感染关键分子及潜在的抗HBV药物作用靶点。

其次是发现HBxAg可与HSP60、HSP70形成复合物；HBxAg与MIF蛋白具有相互作用，这种相互作用在HBV致肝细胞癌中发挥重要作用。

此外，他们发现，在以上HBV感染相关分子中，抑制Fibronectin、ASGPR1、ABHD2、EREG的表达可抑制HepG2.2.15细胞培养液中HBVDNA、HBsAg和HBeAg的水平，而不影响HepG2.2.15细胞的增殖，因此有可能成为抗HBV的潜在作用靶点。配基、小分子化合物等对Fn的进一步验证显示，Fn有可能成为治疗HBV感染的潜在作用靶点。对靶向Fn、ASGPR1、ABHD2、EREG的反义寡核苷酸FN1、AS2、AB3以及E3进一步设计其正义序列、随机序列，以其为对照进行研究，结果显示：这4条反义序列均特异且剂量依赖性地抑制HepG2.2.15细胞中相应mRNA、蛋白的表达以及HBV的复制，提示其可能成为治疗HBV感染的新型先导结构。研究还发现，能抑制Fn表达的0412可在细胞模型以及鸭乙肝模型上抑制HBV的复制，这提示其可能成为治疗HBV感染的新型先导结构。