恩替卡韦药物研究及临床试验情况

肝脏电子快讯 Vol.6 No.4　2003-6-30 朱玫 姚光弼

　　自从拉米夫定作为唯一被批准上市的口服核苷类药物投入市场以来,在抑制乙肝病毒(HBV)复制，降低病毒载量，使血清丙氨酸转氨酶(ALT)降至正常，e抗原转阴及肝组织炎症坏死的改善等方面取得了确切的疗效[1]。但长期应用拉米夫定可使HBV发生变异，降低病毒对拉米夫定的敏感程度，以及停药后出现病毒复制的反跳。因此国际上研究开发了多种核苷类的抗病毒药物，以克服耐药性。恩替卡韦是国内外正在进行临床试验的一种新抗HBV药。

　　恩替卡韦是一种2 ’-戊环脱氧尿嘌呤核苷类似物,具有极强的抗肝炎病毒能力[2]。它的化学命名为[1s- (1α，3α,4β)]-2-amino-1，9-dihydro-9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methylenecyclopentyl]-6H-purin-6-one monohyxdrate。分子式：C12H15N5O3·H2O。分子量：295.3。结构式见图1[2]。

图1. 恩替卡韦结构式

　　药理和毒理 体外实验中，对不同的培养细胞，恩替卡韦的毒性各不相同。在人HepG2.2.15肝脏细胞中，其致半数细胞毒性所需浓度(CC50)为30μM [3]。因此，恩替卡韦体外的细胞毒性很低，选择指数大于8000[3,4]。

　　恩替卡韦的毒性低，在小鼠、大鼠、狗、猴等的实验中，一次服用或反复多次服用每次15 mg·kg -1～200 mg·kg -1(大于临床治疗剂量0.5mg/d几十倍至几百倍)，未发现对主要器官有毒性反应。狗服用上述剂量1个月以上，可出现中枢神经系统血管周围炎症，为可逆性，有种族的特异性，其它动物实验中无此现象。若每次剂量15 mg·kg -1，第85天时，大鼠和狗的骨髓、淋巴器官有轻度退行性病变，表现为血红蛋白、红细胞、白细胞等计数轻~中度下降，MCV和MCH轻度上升；雄性大鼠和狗有睾丸泌精管的退化。停药后这些病变是可逆的或部分可逆。每次剂量40 mg·kg -1，连续服用12个月，对猴的主要器官无明显毒性反应，且未见药物蓄积现象。

　　对啮齿类动物致癌性实验中，当每次用量超过人体每日剂量5倍时，雄性小鼠良性肺腺瘤发生率上升，有种族的特异性；当超过人体每日剂量的43~62倍时，雄性大鼠脑神经胶质瘤、肾肿瘤等的发生率上升；雌性大鼠肝腺瘤、子宫血管瘤等的发生率上升。这样的剂量与人体安全使用恩替卡韦无相关性。遗传毒性研究表明恩替卡韦不具有生殖毒性。妊娠家兔使用剂量超过临床治疗量约375倍时，可引起胚芽－胚胎的骨化延迟。

　　恩替卡韦及其三磷酸衍生物对线粒体的氧化代谢无明显影响，对哺乳动物正常细胞的聚合酶仅有轻微抑制。

　　动物药物动力学 恩替卡韦口服吸收迅速，鼠和狗的生物利用度分别为37～80%和90%以上，Tmax约1h。静脉输注本品后，其稳态分布容积为1.02～4.63L·kg -1，高于总体液量，提示有广泛的组织分布，肾脏内浓度最高。血浆蛋白结合率低。鼠、狗、猴的血浆终末半衰期分别为2.1～4 h，3.8～9 h和6h。体内代谢率很低，主要在肾脏以原形排泄(约60～80%)，其他代谢产物有葡萄糖醛酸结合物和二种硫酸结合物。

　　药效学 在体外实验中，5μM用同位素标记的恩替卡韦与HepG2.2.15人肝脏细胞共同孵育三天，细胞内三磷酸恩替卡韦的浓度为65.8%，相同条件下测得三磷酸拉米夫定浓度为11.6%。恩替卡韦抑制转染的HepG2.2.15细胞内HBV DNA复制的半数有效浓度(EC50)为3.75nM，而拉米夫定为116 nM，比前者低30倍以上[3]。

　　在美洲旱獭肝炎病毒(WHV)的慢性感染中，口服恩替卡韦(0.05mg·kg-1·d-1)治疗4周后，血清病毒 DNA量已有明显下降，至32周时DNA量降低了8个log10，即使较低剂量(0.02mg·kg-1·d-1)，亦有明显效果。在治疗14个月后，取肝穿刺标本检测核心抗原和cccDNA均为阴性。停药21个月后血清中仍测不出病毒 DNA，这表明恩替卡韦不仅能抑制病毒的复制，而且对cccDNA亦有直接的影响。初步结果表明，恩替卡韦还可减少或延迟美洲旱獭肝细胞性肝癌的发生。对照组中所有美洲旱獭均在4年内死于肝细胞性肝癌，5只美洲旱獭接受持续3年的治疗，每周给药一次，经检测血清中WHV DNA持续下降，肝细胞内cccDNA可测不出，经长期治疗无病毒变异及耐药迹象，仅有1只美洲旱獭发生肝细胞性肝癌[2，4]。

　　作用机制 恩替卡韦的作用靶点在HBV DNA聚合酶和反转录酶，通过抑制该酶，从而抑制前基因组RNA逆转录复制HBV DNA负链，进而抑制正链的合成，以阻断HBV DNA的装配和延伸。恩替卡韦经口服吸收进入肝细胞后，通过磷酸化作用成为三磷酸恩替卡韦(ETV-TP)，它是恩替卡韦在肝细胞内抑制HBV DNA聚合酶的活性形式，三磷酸恩替卡韦的半衰期为14-15个小时，作用较持久[5]。对HBV DNA的起始、逆转录复制负链和正链合成三个步骤的平均抑制浓度分别为0.30、0.32和0.18，而三磷酸拉米夫定的平均抑制浓度分别为>400、1.44和3.94。ETV-TP对HBV野生株的半数抑制浓度(IC50)为0.43±0.06nM，对YMDD变异株：M550V、L526M和V553I的IC50分别为4.2±1.3nM、0.67±0.09nM 和0.54±0.08nM [5]。

　　临床药物动力学 恩替卡韦口服吸收良好, 到达峰浓度时间(Tmax)(中位数)：0.63～1h。口服0.5mg，最大峰浓度(Cmax)：4.3 - 6.7ng·ml-1，曲线下面积(AUC)：15-17.8ng·h-1·ml-1，肾的总清除值(CLR)：360.03-376.37ml·min-1。在0.1～1mg剂量范围内，在服药后5～10天达到稳态分布，AUC、Cmax与剂量呈线性关系，CLR和Tmax与剂量无关[6]。多剂给药，稳态时AUC与首剂时AUC之比约为≥2，按此累积比计算，恩替卡韦的有效血浆半衰期在20～24 h。进食会降低恩替卡韦血药浓度的峰值，特别是高脂餐可使Cmax下降51%，AUC下降21%。恩替卡韦均匀分布于人的红细胞和血浆中，血浆蛋白结合率低于13%，与高血浆蛋白结合率药物之间无相互作用，对人的细胞色素P450、3A4和2D6无抑制作用。恩替卡韦主要以原型通过肾小管的主动分泌而排出体外[6]。若肾功能不全可能会影响药物的清除。

　　病毒动力学与药物的关系 应用恩替卡韦0.5mg·d-1，慢乙肝病人血清中HBV DNA的下降可分为二个时相：第一时相为游离病毒的清除，平均时间为16h(范围：12-29 h)，第二时相为被感染肝细胞的清除，平均时间为10.7d(范围：5.2-31.8d)。 恩替卡韦抑制病毒复制的平均效率为96%。而停药后病毒复制的反跳亦可用反向的双相模型来描述。经计算，从病毒量回升的第一时相(即病毒浓度快速增长的持续时间)到第二时相平均需30d(范围：12-109d)，病毒反跳的第一、第二时相与停药时测得的病毒量、与恩替卡韦的剂量之间，均无相关性[7]。

　　临床疗效 在301名健康志愿者中，已进行口服恩替卡韦单剂量(范围：0.5-4.0 mg·d-1)和多剂量(范围:0.1-20 mg·d-1)试验，以研究恩替卡韦的安全性和药代动力学。结果显示低剂量常见不良反应为排尿困难和腹泻；高剂量组为头痛、眩晕、腹痛、恶心、光过敏等。所有反应均轻微而温和，大多数病人继续服药可自行缓解。

　　已进行的双盲、随机、多中心，为期24周的Ⅱ期临床试验，将3个剂量的恩替卡韦(0.01，0.1，0.5 mg·d-1)和拉米夫定(100mg·d-1)的疗效作比较，169例慢性乙型肝炎病人参加了试验。治疗4周后，各组慢乙肝病人血清HBV DNA水平均呈下降趋势，但0.01 mg·d-1的疗效明显不足。治疗至22周时，0.1和0.5 mg组病人血清HBV DNA下降数值分别比拉米夫组高出0.97 log10 和1.28 log10，显示出清晰的量效关系。0.5 mg组有83.7%的病人血清中检测不到HBV DNA(bDNA法)，而拉米夫定组为57.5%，见图2。各组间ALT复常率和HBeAg/抗HBe转换率无明显差异。停药后ALT升高超过基线值３倍以上者，0.1 mg组为3%，0.5 mg组为4.5%，拉米夫定组为10.5%。因而恩替卡韦的疗效优于拉米夫定。由于试验过程较短，在169例慢乙肝病人中，有25例(15%)应用Knodell肝炎活动指数(HAI)评估治疗前后肝组织学的改变，其中6例有改善，3例恶化，16例无改变[8]。

图2. 基线和用药后4, 12, 22周HBV DNA log10值变化的中位数（用Amplicor PCR法检测）
　　　　　　　　　　　　　[引自：Lai CL, et al. Gastroenterology 2002, 123 (6): 1831-1838.]

　　目前世界各地正在进行恩替卡韦Ⅲ期临床试验，入选的1289例慢乙肝病人，随机分成了三个试验组。对照组服用100mg·d-1的拉米夫定，恩替卡韦组的病人若以前未经治疗则接受0.5mg·d-1，若是拉米夫定治疗失败者则接受1.0mg·d-1。治疗48周后，进行疗效评估。评估有效性的主要指标是各组病人肝组织学的改变，和/或用bDNA法检测不出HBV DNA；其次是bDNA和PCR法均检测不出HBV DNA；HBV DNA下降的平均log10值；肝细胞内cccDNA量；HBeAg消失；出现HBeAg/抗HBe血清转换；ALT复常；病毒发生耐药。对完全应答者[HBeAg(-)、HBV DNA(-)、和/或ALT复常]，停药并进行24周随访，以观察疗效的持久性和安全性。对部分应答者继续治疗48周，至HBeAg消失，和/或血清ALT复常。完成二次肝穿刺的病人必须达到80%以上。

　　181例拉米夫定治疗失败病人[治疗至少24周以上，出现YMDD变异或血清HBV DNA水平≥10Meq/ml(bDNA法)，ALT≤10倍正常值]，按1:1:1:1随机分成4个组，恩替卡韦组(0. 1，0.5和1.0 mg·d-1)和拉米夫定(100mg·d-1)，疗程48周。治疗结束时，恩替卡韦组病人血清HBV DNA下降数值(log10)分别为2.78、4.46和5.11，而拉米夫组为1.41。用PCR法测不出HBV DNA的比率为4%(0.1 mg组)和26%(0.5和1.0 mg组)，拉米夫组为4%。ALT恢复正常的比率分别为43%、59%和68%，拉米夫组为6%。未出现与恩替卡韦相关的病毒变异及耐药现象。1.0 mg恩替卡韦对此类病人的疗效最佳[11]。

　　试验表明恩替卡韦不仅有较强的抗病毒能力，而且由于不同的作用机制，长期应用耐药的发生率较低。其他相关的研究显示，它是新的很有希望的核苷类抗病毒药物，对肝细胞内cccDNA有直接抑制作用，可有效地治疗慢性乙型肝炎，目前正在评估其长期应用的有效性和安全性[8]。慢乙肝病人抗病毒治疗的发展趋势是联合用药。

参考文献

1. Liaw YF, Leung NWY, Chang TT, et al. Effects of extended Lamivudine therapy in Asian patients with chronic hepatitis B. Gastroenterology 2002, 119 (1): 172-180.

2. Colonno RJ, Genovesi EV, Medina I, et al. Long-term entecavir treatment result in sustained antiviral efficacy and prolonged life span in the woodchuck model of chronic hepatitis infection. The Journal of Infections Diseases 2001, 184: 1236-1245.

3. Innaimo SF, Seifer M, Bisacchi GS, et al. Identification of BMS-200475 as potent and selective inhibitor of hepatitis B virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1997, 41 (7): 1444-1448.

4. De Man RA, Wolters LMM, Nevens F, et al. Safety and efficacy of oral Entecavir given for 28 days in patients with chronic hepatitis B virus infection.Hepatol 2001, 34 (3): 578-582.

5. Levine S, Hernandez D, Yamanaka G, et al. Efficacies of Entecavir against Lamivudine-resistant hepatitis B virus replication and recombinant polymerases in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2002, 46(8): 2525-2532.

6. Yan JH, Bifano M, Nichola P, et al. Entecavir pharmacokinetics after multiple doses in healthy subjects.
Proceeding 31st Annual Meeting of the American College of Clinical Pharmacology, 21-23 September, 2002, San Francisco, CA. Poster Number 086.

7. Wolters LMM, Hansen BE, Niesters HGM, et al. Viral dynamics during and after entecavir therapy in patients with chronic hepatitis B. Journal of Hepatology 2002, 37: 137-144

8. Lai CL, Rosmawati M, Lao J, et al. Entecavir is superior to Lamivudine in reducing hepatitis B virus DNA in patients with chronic hepatitis B infection. Gastroenterology 2002, 123 (6): 1831-1838.

9. Entecavir is effective in treating patients with chronic hepatitis B who have failed Lamivudine therapy.
Hepatol 2001, 34 (N04, pt2). A 673.

10. Seifer M, Hamatake RK, Colonno RJ, et al. In vitro inhibition of hepadnavirus polymerases by the triphosphates of BMS-200475 and Lobucavir. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998, 42 (12): 3200-3208.

11. Sustained viral load and ALT reduction following 48 weeks of Entecavir treatment in subjects with chronic hepatitis B who have failed Lamivudine Hepatol 2002, 36 (N04, pt2). A 550.

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