HBVDNA定量检测临床应用问题与思考
作者 第二军医大学附属长征医院 赵克开 缪晓辉
HBV DNA检测技术目前已经在临床中普遍应用。但在实际工作中，不少临床医师对如何认识、评价和使用 HBV DNA检测结果仍存在着一些困惑，甚至可能因认识不足、应用不当导致了错误的诊断和治疗。现就 HBV DNA定量检测临床应用的基因诊断和临床治疗研究阐述如下。
一、如何正确认识和评价 HBV DNA 定量检测试剂盒的灵敏度
任何一种基因检测技术都有一定的灵敏度，即该方法的最低检测限。目前公认的 HBV DNA 定量检测国际“金标准”是罗氏公司生产的 COBASAmpliPrep-COBAS TaqMan(CAP-CTM) 实时荧光 PCR HBV DNA 定量检测试剂盒，其血清 HBVDNA 检测灵敏度为 170 拷贝／mL (30 IU/mL)。有学者将雅培公司生产的 HBV DNA 定量检测试剂盒与 CAP-CTM 进行了比较，发现两者灵敏度相似。
目前，国产的 HBV DNA 实时荧光 PCR 定量检测试剂盒灵敏度为 1×103 拷贝／mL，与国外产品尚有一定差距。虽然某些国产试剂盒声称检测灵敏度可达 250 或 300 拷贝／mL，但无充分实验室或临床证据。
有研究显示，将 24 份罗氏公司第一代产品 COBAS Amplicor 试剂盒 HBV DNA 定量在 300-1000 拷贝／mL 的患者血清，分别采用 2 个国产 HBV DNA 试剂盒进行检测，发现后者的漏检例数分别达 11 例 (45.83%) 和 22 例(91.67%)。
与国产试剂盒相比，罗氏公司的 CAP-CTM 检测系统之所以具有较高的灵敏度，除试剂本身的质量及配套的仪器性能等因素外，从技术层面看，尚有其他重要原因：①该检测系统在从血清中分离、提取 HBV DNA 时，采用的是全自动的 HBV DNA 提取系统 COBAS AmpliPrep，且采用的是磁珠吸附柱纯化，尽可能地避免了提取过程中 HBV DNA 的丢失，而国产试剂盒均采用手工提取，且多为煮沸法、Chelex 树脂法等，提取过程中 HBV DNA 丢失较多。有学者研究发现，即使采用同一检测试剂，血清标本的处理方法对 HBV DNA 检测结果也有着直接的影响，煮沸法和 Chelex 树脂法阳性检出率仅为吸附柱核酸纯化法的 52.78% 和 55.56%。在阳性标本中，同一标本的定量值也较吸附柱核酸纯化法低 1-2lg拷贝/mL。
②该系统用于检测的每份血清标本量较大。CAP-CTM 试剂盒用于检测的每份血清量达 650 uL，而国产 HBV DNA 检测试剂盒用于检测的血清标本量一般仅为 50-100 uL，但两者提取到的待测 HBV DNA 产物容积一般均为 50 uL。而且，由于反应管体积的限制，进行 PCR 检测时只能再取其中的 2-5 uL 的 HBV DNA 提取产物作为 PCR 检测的模板。
在血清 HBV DNA 含量较低时（1×103拷贝 /mL 以下），在有限的 2-5 uL HBV DNA 提取产物中，能“抓到”多少 HBVDNA 分子进入到 PCR 检测反应管，并被仪器“捕捉”到荧光信号，就存在着一个概率问题：进入检测体系的血清标本量越多，“抓到”足够多的 HBVDNA 分子的概率就越大，荧光仪捕捉到荧光信号的概率也就越高；反之，血清标本量越少，检出概率越低，漏检率也就越高。显而易见，罗氏试剂盒由于增加了进入检测体系的样品容积，其敏感度理论上就比国产试剂盒提高 6-13 倍。
国产 HBV DNA 定量检测试剂盒的灵敏度偏低可以解释某些临床现象：①CHB 或乙型肝炎肝硬化患者多次检测血清 HBV DNA<1×103拷贝 /mL，在除外合并脂肪肝、药物性肝损害等其他病因后，仍反复出现血清 ALT、AST 升高；
②或在接受抗病毒治疗后，监测血清 HBV DNA 已长时间处于不可测水平以下，但血清 ALT 和 AST 即使加用“降酶药”后仍持续异常。其中的原因可能就是患者体内存在低水平的 HBV 复制，但国产试剂盒却未能检测出。
鉴于我国大多数乙型肝炎患者的经济承受能力有限，没有必要普遍推广使用高灵敏度、高成本的进口试剂盒，因为目前尚无彻底清除 HBV DNA 的药物，即使患者血清 HBV DNA 降到更低的不可测水平，甚至发生血清 HBsAg 转换，但肝脏中仍然会有 HBV DNA 或 HBV cccDNA 存在。
在抗病毒治疗的动态监测过程中，只要患者血清 HBV DNA 持续 <1×103拷贝／mL，结合生物化学、影像学和（或）组织学等指标，就足以对疗效进行恰当的评价。只有在 HBV DNA 水平用国产试剂盒检测 <1×103 拷贝／mL，但①患者未经治疗，ALT 持续异常；②或在抗病毒治疗过程中，出现 ALT 持续不能复常，或复常后又反弹；③或肝脏影像学、组织学有进展；④或有肝硬化、肝细胞癌家族史等高危因素；⑤或 HBV 血清学标志物阴性、但疑有隐匿性乙型肝炎等少数情况下，可以考虑使用高灵敏度的 HBV DNA 检测试剂盒。
二、如何看待 HBV DNA 定量检测试剂盒的检测线性范围
任何检测方法，只有在一定的范围内才有效，即该方法检测的线性范围。检测线性范围包括检测的上限和下限，下限即为检测灵敏度，上限即为其最高检测浓度，待测标本中，如目标分子的浓度低于检测下限可能导致漏检；如高于检测上限，由于高浓度底物的抑制效应，亦有可能导致误检甚至漏检。
影响 HBV DNA 定量检测试剂盒线性范围的因素有：①定量标准品设置的范围。荧光定量 PCR 检测时，一般均采用标准曲线法，只有检测数值位于标准品的定量范围内，结果才是有效的、准确的，不能通过统计公式任意加以外推。部分国产 HBVDNA 定量检测试剂盒说明书上标明检测线性范围为 500-1×108 拷贝／mL，但实际可能只有 1×104、1×105、1×106 和 1×107 拷贝／mL 4 个数量级的标准品，显然是不严谨的。
如待测标本的检测结果低于 1×104 拷贝／mL 或高于 1×10 7 拷贝／mL，均是不可靠的。②检测试剂的质量，如 PCR 引物和荧光探针的保守性、通用性，试剂盒所采用的 Taq 酶的扩增能力、热稳定性，以及反应体系抗干扰系统的设置等，均会直接影响 PCR 的扩增效率和检测线性范围。
HBV DNA 检测试剂盒的线性范围越大，表明其检测效能越高。罗氏、雅培和 Qiagen 公司的 HBV DNA 定量检测试剂盒的检测线性范围分别为 30-1×108 IU/mL、10-1×109 IU/mL 和 20-1×108 IU/mL。根据作者多年的基因实验室和临床工作经验，多数国产试剂盒的线性范围在 1×103-1×108 拷贝／mL，虽检测效能较国外试剂盒小2个数量级，但基本能满足临床需要。
建议对于使用国产试剂盒检测结果为 1×108 拷贝／mL 或以上的血清标本，实验室技术人员可常规对标本进行 1:100-1:1 000 的稀释，然后再次进行检测。这样能确保血清高载量 HBV DNA 的样品检测结果更准确，在抗病毒疗效监测中也能更有效地反映患者实际 HBV DNA 的下降程度。
三、如何看待不同实验室之间 HBV DNA 载量检测结果和单位的差异
常会看到同一患者提供的在同一家医院相近时间段（未经抗病毒治疗），或同期在不同医院（实验室），所测得的 HBV DNA 载量有差异，甚至有很大差异。究其原因，应该包括两个方面：一是检验技术本身固有的“缺陷”，或必然存在的误差；二是试剂、设备和人员技能的差异。
由于 HBV DNA 检测结果是指数形式，且 HBV DNA 本身易发生突变而影响引物和探针的结合，因此不同厂家的 HBV DNA 检测试剂盒之间的检测结果不具有可比性。
在一项研究中，来自美国 9 个独立实验室的学者，对 67 份血清标本分别采用雅培公司的 HBV IUO、罗氏公司的 CAP-CTM 和 HighPure-CTM、Qiagen 公司的 artus HBV TMASR 等 HBV DNA 检测试剂盒进行检测，发现尽管上述试剂盒在检测下限、线性范围、可重复性方面均较好，但①检测结果的中位数以 CAP-CTM 最高，artus HBV TM ASR 最低；②检测结果的可重复性以具有全自动 DNA 提取系统的试剂金较好；③所有试剂盒均有假阳性结果，其中使用手工 DNA 提的试剂盒发生率较高。
鉴于不同方法、不同买验室检测结果之间的差异，欧洲肝病研究会指南特别强调，对治疗过程中 HBV DNA 的随访监测，同一患者需要采取同一种方法。我国有关核苷（酸）类药物耐药预防与管理的专家共识也明确指出，为确保检测结果的稳定性和一致性，对于在同一地方就诊的同一患者，应坚持采取同一种检测方法进行评估。
HBV DNA 定量检测结果以拷贝／mL表述较为直观，易于为临床医师和患者理解。但如采用不同厂家试剂盒进行检测，且结果用拷贝 /mL 表述，其差异较大，不便于比较。
为解决这一问题，由 9 个国家、22 个实验室组成的协作组，对 3 份阳性血清标本采用不同厂家的 HBV DNA 试剂盒进行检测，并将检测结果进行标准化，最后产生一份来自欧洲的“标准血清”（代号 97/746），作为 HBV DNA 核酸扩增检测技术的标准品，定义为 1×106 IU/mL（5×105／反应管），这一标准已被世界卫生组织 (WHO) 所承认。2006 年，该标准血清被一代号为 97/750 的新标准血清取代。
各试剂生产厂家如罗氏、雅培、Qiagen 等，均把待测样品的实测值（拷贝 /mL），用 WHO 的标准血清检测结果进行标化后，赋予标准化值，即 IU/mL。
不同厂家的试剂盒，拷贝／mL 与 IU/mL 的换算系数不同：罗氏公司 CAP-CTM 试剂盒 1 IU/mL=5.82 拷贝／mL，Qiagen 公司的 ReaIArt HBV PCR 试剂盒 1 IU/mL=6 拷贝／mL，西门子 VERSANT HBV DNA 试剂盒 1 IU/mL=5.7 拷贝／mL，雅培公司实时荧光定量 HBV PCR 试剂盒 1 IU/mL=3.41 拷贝／mL。
但为便于临床医师计算，目前国内外相关指南均统一采用 1 IU/mL=5 拷贝／mL进行换算。需要特别指出的是，目前部分国产试剂盒的报告单位“IU/mL”与“拷贝／mL”的实际换算系数是 1，但为了人为地“与国际接轨”，把报告单位标注成“IU/mL”。
四、如何看待与处理 HBV DNA 定量检测结果的假阴性与假阳性
任何检测方法均可能存在假阴性和假阳性。所谓 HBV DNA 定量假阴性是指标本中存在 HBVDNA 却未能检测出来，假阳性是指本来不存在 HBV DNA 却报告检测出阳性结果。
造成 HBV DNA 定量检测假阴性的常见原因有：①HBV DNA 检测试剂盒灵敏度较低，使 HBVDNA 载量较低的标本漏检；②标本采集、运送或保存不当，导致 HBV DNA 被 DNA 酶降解、断裂；③标本中存在抑制 PCR 过程的物质，如肝素抗凝、血脂过高、溶血等；④HBV DNA 发生变异，致使 PCR 检测的引物、探针与 HBV DNA 靶片段不能有效互补结合，不能形成扩增产物或无法产生荧光信号。
作者曾接诊 1 例 HBsAg、HBeAg 阳性 CHB 患者，其未曾进行抗病毒治疗，多次在外院查肝功能均示 ALT 升高，但同时多次查 HBV DNA 均 <1×103 拷贝／mL，并排除合并其他病因，该医院同期其他患者的检测结果亦未发现异常。后该患者在解放军第四 O 四医院复查 HBV DNA 为 5.6×106 拷贝／mL，HBV DNA 测序发现，该患者 HBV DNA 在外院检测时试剂盒所采用的正义 PCR 引物 3’末端存在两个碱基的突变。
造成 HBV DNA 检测假阳性的原因：①标本被污染；②因操作不当或试剂质量等原因导致扩增曲线不平滑、不稳定，在一定热循环数以后扩增曲线出现折线或“翘尾”现象，被系统误检为阳性信号。后者可导致一种令临床医师和患者特别困惑的现象，即已长时间抗病毒治疗的患者，突然检测到低水平的血清 HBV DNA，一般在最低检测限左右，如 (1-2)×103 拷贝／mL，被误以为病毒学反弹或复发，但立即到不同医院或同一医院进行复检，结果 HBVDNA 低于检测下限。对于此种结果，最好的处理办法是进行重复检测。
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