核苷类抗乙肝病毒药物研究近况—姚光弼

　　上海静安区中心医院 200040 姚光弼

　　自从拉米夫定于1998年被FDA批准治疗慢性乙型肝炎以来,国外的一些研究机构和制药公司投入了可观的资源开发新的抗乙肝病毒(HBV)药物。特别由于长期单独应用拉米夫定可导致病毒变异或耐药性,新的药物需克服这个缺点。从现有的临床资料看来,一些开发的新药对变异株导致的耐药性有效,为攻克慢性乙肝又前进一步。

　　药物构型与抗病毒活性的研究

　　根据"非天然"(合成的)核苷类系列的结构构型与抗病毒活性(Structure-Activity Relationships;SARs)研究,发现β-L-2'-脱氧核苷类具有抑制HBV的特异性(表1)。在体外实验中应HBV转染的细胞如：2、2、15细胞株,H61细胞株等,以筛选抗HBV核苷类药物的抗病毒效价。通常用EC50(μM)表示能抑制病毒50%的浓度(μM),凡浓度越低其抑制病毒效力越强,反之其抑制效力则低。β-L-2'-脱氧戊糖的3'-OH基对于其抗HBV的特异性至关重要,其中以L-dC (L-脱氧胞嘧啶),L-dT (L-脱氧胸腺嘧啶)和L-dA (L-脱氧腺嘌呤)具有很强特异性抑制HBV的活力,对其他病毒如HIV则无抑制作用。对人类线粒体的DNA聚合酶(α,β和γ)和线粒体功能无影响。如在L-dC 的嘧啶环的第5位的碳基被卤素取代,其抗HBV活力降低,但对HBV仍有特异性。如其脱氧核糖缺少3'-OH基,仍具有抗HBV活力,但其特异性降低,对HIV也有抑制作用,如：3TC,FTC。同样,其3'-OH被卤素取代,其抗HBV的特异性消失,但仍保留对HBV和HIV的抑制活性。如同时取代嘧啶环的第5位和缺少3'-OH,将进一步降低对HBV和HIV的抑制活性。根据体外细胞培养的研究结果表明β-L-2'-脱氧戊糖的3'-OH基在抗病毒作用中起着关键的作用。以L-dC为例,在土拨鼠的动物模型中,口服10mg-1kg-1d-1血清WHV DNA于第1周时下降1.5log10拷贝/ml,于8周时下降达8 log10拷贝·ml-1,远高于相同剂量的3TC。

　　药物对HBV 复制动力学的影响

　　评价抗病毒药一般采用比较治疗前后血液内病毒载量(负荷量)降低多少的方法,一般有效的药物至少应使循环内HBV DNA下降2-3log10·ml-。最近,应用数学模型的方法,计算出抗病毒药对病毒复制动力学的影响,可以更好地了解和比较不同药物的疗效。如在给药后定期检测血液内的病毒载量(拷贝·ml-)绘成曲线,可以将抗病毒药的作用分成：诱导相和维持相,前者又可分成：第1和第2二个时相。用数学公式模拟病毒量降低的曲线可以计算出游离病毒和细胞内病毒清除率,以及对病毒的抑制率。这种方法可以更精确地评估和预测药物的疗效。目前已用于HBV、HCV和HIV治疗的研究。表2列举4种药物对HBV复制参数的影响。

　　表2 抗病毒药治疗病毒复制动力学参数比较

　　新的核苷类药物

　　一、 阿德福韦(Adefovir dipivoxil,ADA)

　　已进入III期临床试验,在全球78个医院进行国际者的合作研究,515例HBsAg阳性、HBV DNA载量>106 copies/ml的慢乙肝病人试验。病人随机分成三组10mg·d-1 x 48 WK。30mg·d-1 x4 WK,随后10mg·d-1 x44 WK;以及安慰剂x 48 WK。48 WK后,安慰剂组改为10mg·d-1 x 48 WK,30 mg改为服安慰剂48 WK,10 mg组随机分成10mg·d-1 和安慰剂x48 WK。以肝活检作为主要的终点结果,药物安全性、血液HBV DNA、HBeAg/抗HBe和ALT等次要终点。根据中期报告,ADV10mg和30mg,二种剂量对于抑制病毒有明显疗效,HBV-DNA降低3-4log10拷贝/ml,442例在48周时作肝活检,ADV治疗病人的肝组织坏死炎症程度较安慰剂组明显改善,HAI指数大于2。常见的不良反应咽炎、头痛、哮喘、腹痛、流感样症状等,大多数耐受,2%由于药物不良反应而停药。另一个报告,在II期临床试验结束后39例病人延长服用ADV 30mg·d-1中位数时间77WK(4-126WK)。如出现血肌酐增高,改为10mg·d-1。病人获得持续病毒抑制,24WK、48WK、76WK时血清HBV载量分别比治疗前降低3.68、3.32和3.28log10拷贝·ml。35%病人血内测不到病毒(PCR法,<400拷贝·ml)。39%HBeAg阴转,14%血清转换。常见到实验室不良反应有低磷酸血症,ALT和AST增高,3例(8%)由于血清肌酐较基线值≥0.5mg·dl而停药。12例(31%)由于与药物不相关的严重不良反应而中止治疗。会议的报告提及服用阿德福韦30mg·d-1因血清肌酐升高和肾毒性需减量为10mg·d-1。根据Gilead公司收集到服用ADV达72-136周的39例病人,未发现有HBV聚合酶的变异株后耐药性产生。应用ADV治疗HBV合并HIV感染病人35例,剂量10mg·d-1,48WK时HBV DAN降低4.07±log10拷贝·ml,50%病人肝组织学炎症坏死改善,HAI指数降低≥2。40例失代偿乙肝有肝硬化病人,曾用拉米夫定治疗出现耐药,加用ADV治疗后,24WK时HBV DNA降低3.9log10拷贝·ml-,伴有ALT、胆红素和白蛋白的改善。

　　二、 恩替卡韦(Entecavir)

　　已结束II期临床试验,进入III期临床试验。181例曾接受拉米夫定治疗HBV DAN仍大于b.DNA法10Meq·ml-1或已发生YMDD变异者,随机分成恩替卡韦0.1ml,0.5mg,1mg或拉米夫定100mg·d-1,治疗52WK。分析第24WKbDNA法HBV DNA阴转率(<0.7 Meq·ml-1),以上4组病人分别为19%、53%、79%和13%。应用PCR定量法,HBV DNA分别下降1.95 log10、3.85 log10、4.36 log10和0.92 log10。表示0.5mg·d-1和1.0 mg·d-1的抑制病毒效果最好。这4组的ALT复常率分别为37%、60%、36%和21%。9例中止治疗,2例血清淀粉酶增高,1例低血糖,1例为发现有肝癌。5例ALT≥10xULN(正常值上限)(其中2例为拉米夫定治疗组),在后者5例中3例血清胆红素上升,1例发生脑病,但停药后均恢复。其他病人的不良反应为轻度或中度,与用拉米夫定或恩替卡韦过去报告相似,在52WK内未发现有致癌作用。

　　三、 依曲西他平(Emtricitabine,氟硫代胞嘧啶FTC)

　　98例II期临床试验,随机分成25mg·d-1、100mg·d-1和200 mg·d-3组,其中HBeAg阳性77例,阴性21例。经48周治疗,3组病人血清HBV DNA降低2.59、3.12和2.92log10拷贝ml。77例HBeAg阳者,31例(40%)阴转,100mg和200组中,分别有4例(12%)和2例(6%)出现了变异株和耐药性(M550I/V±L 526M)。ALT中位值从治疗前的51-81U·L-1,降至25-29 U·L-1。5例发生严重不良反应,其中1例认为与药物有关。另报告对98例HBeAg阴性,HBV DNA用bDNA测定>3MEq·ml-1的病人。分别给予25mg·d-1、100mg·d-1和200 mg·d-1治疗48WK。治疗结束时此3组病人HBV DNA分别降低2.37、2.49和2.64log10拷贝·ml。ALT从治疗前42-82 U·L-1降至20-25 U·L-1。未观察到药物相关的严重不良反应。

　　四、L-脱氧胸腺嘧啶(LDT)

　　L-dT在体外实验和土拨鼠动物模型对HBV和土拨鼠肝炎病毒有很强的抑制作用。药代动力学研究表明25mg至400mg剂量的范围内,药物剂量与Cmax和AUC成线性关系。35例慢乙肝病人采用逐步增加剂量的方法,分别给予25mg、50mg、100mg、200mg和400 mg·d-1,服药4WK,停药后随访12WK。在第4周结束时,以上5组的血清HBV DNA量分别下降2.4±0.3、27±0.2、3.1±0.1、2.9±0.2和3.63±0.3log10。根据HBV复制动力学模型分析,在治疗第1周(第1相)均见病毒量明显下降。各剂量组差别不大。但于第2-4周(第2相)则可见到剂量与病量降低之间明的关系。认为第2相时病毒的清除在决定疗效时的重要性。35例服用L-dT4周,无明显不良反应,安全性好。

　　五、 Ly582563 (MCC-478)

　　为ADV的衍生物,化学名：2-amino-9-[2-bi's(2,2,2-ticfluroethoxy) osphoryl-methoxyl]ethy-6　(4methoxyphenylthiolthio)　purine)。体外实验对HBV有很强的抑制作用,对HIV无作用。对YMDD变异株仍有抑制作用。动物实验的毒性比ADV低。在土拨鼠的乙肝模型中,0.5、2.5和10 mg·kg-1d-1剂量,均可使血液内病毒量降低4.log10拷贝/ml以上,停药后且可持续有效。目前已完成了60例的药代动力学和耐受性试验。本品吸收迅速,从10 mg·d-1至60mg-1剂量的范围内,Cmax和AUC与剂量成线性关系。进食可影响药物的吸收。其主要代谢产物为单酯。正在进行慢乙肝病人的药代动力学研究,II期临床试验已启动。

　　六、 β-LFd4C(β-L氟-4-脱氧胞嘧啶)

　　体外实验对HBV和HIV均有抑制,活性比拉米夫定强。口服吸收后经磷酸化成为三磷酸化合物,在细胞内的半衰期>20h。健康志愿者口服5-100mg量,Cmax和AUC成线性关系,口服5mg,血浓度可达IC50(2.0μM)。目前在补充I期临床试验资料和启动II期临床。

　　七、克拉夫定(Clevudine L-FMAU)

　　在体外实验中有很强的抑制HBV作用,IC50平均为0.08μM(0.02-0.15μM)。在土拨鼠模型中,10 mg·kg-1d-1,给药12周,血清病毒量下降达9log10,停药后随访56周,3/4动物未见病毒反跳。I/II期临床试验表明10 mg·d-1和50 mg·d-2种剂量治疗28天均可有效抑制病毒复制,HBV DNA量分别下降2.49和2.69log10。ALT从114·UL-1,降至66·UL-1。但病例数较少,随访期较短,有待累积更多资料。

　　拉米夫定的新资料

　　拉米夫定(LAM)自1998年在全球主要国家批准治疗慢性乙型肝炎以来,经过进一步的研究,证明于本品对抑制HBV复制、促进 HBeAg/抗HBe血清转换,改善肝组织学病变和肝功能的作用,其安全性和耐受性较好。但是在长期应用过程中出现病毒HBV聚合酶基因地变异(简称：YMDD变异),从而降低对药物的敏感产生耐药现象。

　　长期疗效：36例港、台、新加坡的慢乙肝病人在5年内血清转换达病人进行随访,6-36个月。30例(83%)获得持久的治疗应答,其中5例为YMDD变异病人。韩国报告病人获得血清转换后,持久疗效与在血清转换后的用药时间有关。73例病人凡再持续治疗>6mons者,2年随访,90%持久有效;而治疗<6个月者,持久有效率仅为40%。长期LAM治疗可促进HBeAg/抗HBe的血清转换率,但可使YMDD变异率随着疗的延长而增加,特别是未达到血清转换和病毒学复发的病人,由于耐药性的出现使病情恶化。美国和亚洲的研究均指出,长期LAM可使肝组织学病变进步,但如出现YMDD变异伴有病毒学和生化的复发或反跳,组织学的改善可退步或丧失,伴有疾病的进展或恶化。意大利报告38例HBeAg阳性病人治疗2年,第一年时发生YMDD或无变异病人肝组织进步率分别为：54.5%和77.8%,第2年时分别为80%和75%。因此认为即使发生病毒变异多数病人仍可有肝组织学病变得改善。但在这组病人中,2例出现肝功能失代偿。因此对于长期LAM治疗应定期随访,权衡利弊,决定疗程的时间。

　　儿童病人疗效：286例2-17岁儿童病人,随机双盲安慰剂对照治疗52WK后,根据HBeAg状态,全部接受LAM治疗48WK。剂量为10 mg·kg-1d-1,最高不超过10 mg·d-1。18个月时的中期报告结果为HBV DNA阴转率47%,HBeAg阴转32%,ALT复常55%。12mons和18mons病毒变异率分别为19%和33%。

　　肝硬化疗效：43例HBV相关肝硬化病人,7野生株,36例前C区变异株,后者中3例合并HDV感染。用LAM100 mg·d-1或150mg·d-1治疗平均24.3mons(12-48mons)。在mons12时,36例(83.7%)HBV-DNA转阴,ALT正常。3例合并HDV的病人无效。在12-36mons间14例(32.5%)出现YMDD变异和ALT、HBV DNA反跳。用Child评分,11例进步,23例无改变,9例恶化。治疗后病毒持续抑制者,出现肝并发症者为11.1%(3/27例)。如无效或病毒反跳或出现变异病人的肝并发症高达56.2%(9/16)。乙肝肝硬化用LAM治疗可抑制病毒复制改善临床状态,如出现变异或病毒学复发,发生肝并发症(肝衰竭、肝癌、死亡)的危险性很高。在肝硬化长期应用LAM治疗时应注意的。

　　肝移植病人：现已证明高效价乙肝免疫球蛋白(HBIg)和LAM联合应用,对于防止晚期HBV肝硬化于肝移植后发生乙肝复发。肝移植病人于无肝期IV HBIG 10000IU,以后1-6天给予10000IU·d-1,以后根据血清抗HBs滴度给予HBIG,使抗HBs滴度维持在300 IU·d-1以上。同时在肝移植前4-6mons,给予LAM150 mg·d-1。对60例病人术后平均随访15mons。在随访期间发生乙肝复发者为13.4%(8例)。由于在研究早期当时无LAM,只有当乙肝复发时给予LAM。凡用预防性给予LAM者,在随访期间,无1例发生乙肝复发。而复发的8例均为肝移植前HBV DNA阳性,而未用拉米夫定预防性治疗的病人。另一报告也证明预防性LAM和HBIG合用,可明显降低乙肝复发。肝移植前用LAM4周以上(4-6mons)。手术当天及无肝期,IV HBIG各10000IU,术后1-7天,及第4mon和8mon分别IV HBIG 10000IU,以后每4wk IV 5000IU。建议研究在术后第1周抗HBs滴度需>500U/L,第2周后需>100 U·L-1。对乙肝和丙肝病人肝移植的对比研究,凡术前用HBIG和LAM预防的病人,其肝组织学的病变比丙肝轻,进展少。

　　联合治疗：过去报告拉米夫定联合干扰素治疗并不明显增加疗效。最近意大利对151例慢乙肝进行随机、对照、多中心的研究。一组为IFNα2b 9MU·1周三次加LAM 100mg·d-1,共24WK。另一组为LAM100mg·d-1共52WK。二者HBV DNA阴转率分别33%和15%,肝活检改善率(HAI≥2),分别为46%和27%。此研究提示大剂量IFN合并LAM优于单用LAM。40例失代偿肝硬化,曾用LAM发生YMDD变异,改用ADV和LAM联合治疗52周,HBV DNA下降3.9log10,ALT下降0.6ULN(41%复常),血清胆红素和白蛋白异常者多见改善。未观察到严重不良反应。另一篇报告用PEG IRN2b(Peg Intron A)与拉米夫定联合应用与单用治疗慢乙肝的比较。病人分成3组,A组为PEG Intron A (聚乙二醇化IFNα2b)100mg QW x48周;B组为PEG Intron A 200mg QW X 4WK, 然后改为100mg QWX44WK;C组为PEG Intron A 100mg加LAM 100 mg·d-1,X48WK。有16例完成了16周的治疗。应用病毒动力学的研究,此三组治疗的抗病毒效率(ε)分别为29.6%、75.8%和92.6%。提示PEGIntron A联合拉米夫定优于单独的治疗。

　　展　　望

　　新一代抗乙肝药物正在迅速发展,为了更有效抑制病毒复制,降低耐药性的发生,联合用药为今后的研究方向。更应开发作用于不同靶点的药物,并研究提高宿主对HBV免疫应答的药物, 期望得到彻底清除病毒。