初见端倪的肝纤维化靶向治疗

　　肝纤维化原因众多，其病理过程属损伤修复反应。由于致病因子持续刺激，导致肝内细胞外基质（ECM）过度沉积，进一步发展将转变为肝硬化甚至肝癌。经动物实验及临床观察，已发现该病是可逆的，但在临床上，自然逆转的病例较少，所以仍须积极治疗。因受制于肝脏的代谢与排泌作用，与肝细胞相比，促纤维化细胞吸收药物不多，常缺乏靶向效应，故多数抗纤维化新药在临床前动物实验阶段即告无效。除了少数中药复方外，至今，尚无用于临床的抗纤维化药物。因此，欲实现肝纤维化逆转，须要针对特定的肝脏细胞进行靶向给药。

　　近年来，越来越多的研究尝试将靶向药物递送系统应用于肝脏疾病的显像检测以及药物/基因治疗，并取得了十分显著的成绩。显然，这些成果给肝纤维化治疗带来了新的希望，不过距离实际应用仍存在一些障碍。本文在此就肝纤维化靶向治疗相关的几个问题作简要梳理。

　　1 肝纤维化靶向治疗的必要性

　　肝纤维化靶向治疗的提出主要基于以下几个理由：（1）肝脏易吸收药物，但药物进入肝脏后主要被肝细胞和/或枯否细胞所吸收，而在纤维化中起主要作用的肌纤维母细胞由于其在肝内细胞群体中所占比例较小，又处于基质包绕之微环境中，药物吸收困难，故治疗效果并不理想。（2）参与肝纤维化的细胞因子众多，其受体分布广泛，抗纤维化药物使其非特异性表达可能诱发意想不到的副作用。（3）非靶向抗纤维化药物的长期应用可能干扰其他器官正常基质代谢和创伤愈合。（4）纤维化多由炎症引起，抑制炎症可能导致免疫系统失衡、巨噬细胞及Ｔｈ２淋巴细胞反应发生改变，或转化生长因子（TGF）β产生异常，可能干扰细胞外基质的正常更新，反而加重纤维化。（5）长期用免疫抑制剂抗炎抗纤维化可能增加机会感染。（6）使用抗凋亡或增加基质金属蛋白酶（MMP）活性的药物可能增加肝细胞癌变或转移的危险性。（7）肝硬化阶段应用降低门静脉压力的药物恐会导致本已较低的内脏和外周血压进一步下降，影响其他生理功能。正因为如此，所以在肝纤维化治疗过程中，上述诸方面均须加以考虑，否则难以收到实效，而靶向给药可能是提升疗效、减轻副作用的理想策略。

　　2 靶点选择

　　靶向治疗的关键之一是选择靶点。在肝纤维化发展过程中，多细胞参与、多因子释放、多种信号通路激活是其突出的病理特点，所以靶点选择应该有两个层次，首先确定靶细胞，其次确定靶分子。

　　2.1　靶细胞选择

　　靶细胞选择的原则是在明确发病机制和肝组织病理变化基础上，选择起关键作用的靶细胞，同时了解疾病进程，不同阶段选择不同的靶细胞。

　　２.１.１　肌纤维母细胞　活化的肌纤维母细胞可源自肝星状细胞（HSCs）、纤维母细胞、骨髓以及胆管上皮或肝细胞间质转分化，因其能产生大量细胞外基质，故被确定为主要靶标，其中又以HSCs最为引人注目。

　　HSCs又称Ito细胞或贮脂细胞，约占肝固有细胞数量的15％，其活化是肝纤维化发生发展的关键环节。正常生理状态下，HSCs增殖很慢，主要参与维生素Ａ（VitA）的代谢，并产生少量的细胞外基质。当肝脏损伤时，在各种炎症介质刺激下HSCs发生活化，转变为肌纤维母细胞表型。活化的HSCs过度增殖，并分泌大量的ECM、细胞因子及其他活性物质，通过自分泌和旁分泌效应，进一步促进HSCs活化、增殖及ECM合成。

　　因为在致病因子作用下，特别是病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、中毒性肝病时，HSCs活化后能产生大量细胞外基质，所以目前针对肝纤维化的治疗研究主要集中于该细胞。但在血吸虫性肝病、自身免疫性肝病、胆汁性肝病、肝内慢性胆管炎等情况下，汇管区纤维母细胞活化、增殖是肝纤维化的关键事件，亦即此种细胞是主要治疗靶标，而不是HSCs。

　　２.１.２　肝细胞　为肝脏的主体细胞，在缺氧和氧化应激损伤情况下，不仅能释放大量的促炎和促纤维化因子，推动肝脏炎症发展以及活化HSCs；而且在疾病后期，缺氧肝细胞还抑制MMP-2活化，减少肝脏ECM降解；再加上肝细胞代谢活跃，对缺氧极为敏感，以及易吸收药物等诸多因素，因此，可将其作为肝纤维化治疗的关键靶点。特别是在纤维化早期，肝细胞损伤占主导地位时，以及晚期，肝内血管改建，肝细胞缺氧明显时。

　　２.１.３　枯否细胞　亦称库普弗细胞，贴附于肝窦壁，为肝内固有巨噬细胞。肝细胞损伤、血中内毒素水平升高、颗粒状异物、致敏淋巴细胞、损伤的内皮细胞等均可使之活化，继之产生各种炎症介质，包括活性氧自由基、花生四烯酸代谢产物、NO、CO、肿瘤坏死因子TNF-α、TGFβ等，不仅损伤肝细胞，介导炎症发展，而且促进HSCs活化和增殖，推动纤维化发展。因此，该细胞也是抗纤维化的重要靶标。

　　２.１.４　肝窦内皮细胞　肝脏血管网丰富，有大量内皮细胞，其中肝窦内皮细胞（SEC）具有极强的内吞能力，包括多种糖蛋白配体、细胞外基质成分（透明质酸、胶原片断、纤维连结蛋白、硫酸软骨素）、免疫复合物、转铁蛋白和铜蓝蛋白等均可被吞入。该类细胞还有抗原递呈能力，并能分泌多种细胞因子、花生四烯酸代谢产物（如前列腺素、白三烯）、内皮素、NO和某些细胞外基质成分。内皮细胞增生、血管生成也是纤维间隔形成的必备条件。最近还发现SEC的旁分泌作用还能调节肝细胞内丙型肝炎病毒复制。显然，该类细胞也是抗纤维化备选靶标。

　　上述细胞中，除了HSCs，把其他细胞作为靶点的肝纤维化靶向治疗研究甚少，孰优孰劣尚不清楚。胆管上皮细胞也与某些类型肝纤维化有关，也是备选靶标之一。

　　２.２　靶点分子选择

　　靶点分子选择的原则是保护肝实质细胞免受进一步损伤（即干扰致病因子关键作用环节、抗缺氧和氧化应激）、抑制促纤维化因子产生或拮抗其作用、抑制细胞外基质合成、促进其降解。下面几个靶点分子及其相关信号通路，近年研究较多，具有代表性。

　　２.２.１　转化生长因子β是肌纤维母细胞激活因子，具有强大的促纤维化作用。在纤维化过程中，TGFβ与细胞分化和细胞外基质沉积密切相关。其能增加多种细胞外基质合成，减少基质降解酶产生并促进酶活性抑制物的合成，还调节整合素的表达。TGFβ信号通路有两条，即Smad依赖性通路和p38/MAPK信号通路。抑制TGFβ活性或阻断其信号通路来治疗肝纤维化、肾间质纤维化和肺纤维化已有尝试。

　　２.２.２　血小板源性生长因子　是HSCs最强的促增殖因子，也可通过上调组织金属蛋白酶抑制因子（TIMP）使MMPs活性受抑，减少ECM的降解；此外还通过和其他细胞因子相互作用而促进肝纤维化进程。PDGF结合到HSCs膜上特异性受体后，激活细胞内相应的信号分子，通过p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径、磷脂酰肌醇3激酶PI3K/AKT途径、Ras蛋白/酪氨酸蛋白激酶途径等将信号转导入核，促进相应靶基因的转录和表达，从而活化HSCs，促进其增殖。因此抑制PDGF及其受体的活性可阻断肝纤维化。

　　２.２.３　结缔组织生长因子（CTGF）　为TGFβ下游分子，主要由活化的HSCs产生，是HSCs增殖的重要刺激因子，在肝纤维化中，激活的HSCs可产生CTGF，反过来CTGF又促进成纤维细胞的增殖、迁移、粘附和ECM的产生。经研究证实CTGF还可以上调Ｉ型胶原及α-SMA表达。显然，该因子也是抗肝纤维化治疗的靶点之一。

　　２.２.４　肾素－血管紧张素系统（RAS）　RAS参与肝星状细胞活性氧的释放并加速肝纤维化进程，且在纤维化的肝脏中血管紧张素转换酶和血管紧张素Ⅱ受体１（AT1受体）表达上调。已有实验研究证实，采用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEIs）或血管紧张素受体阻断剂（ARBs）干扰RAS系统均可抗肝纤维化发展。

　　２.２.５　氧自由基（ROS）和Ｎrf2-Ｋeap-1系统　ROS过度产生不仅损伤肝细胞，还活化RohA，控制细胞粘附和移行。Rho激酶为Rho效应分子，Rho/Rho激酶通路参与多种细胞功能活动，阻断该通路亦有抗纤维化效应。细胞缺氧状况下自由基产生增多，将导致氧化应激损伤；而细胞内转录因子Ｎrf2随之表达增加，该因子能调节多种抗氧化应激基因的基础性和诱导性表达，以保护细胞。Ｎrf2活性受Keap1调节，后者为胞内氧化应激感受器，促进Ｎrf2失活。最近有报道，定位于核内的Ｎrf2能使肌纤维母细胞去分化。Keap1－１对Ｎrf2胞内定位有调节作用，因此Ｎrf2－Keap1－１系统是抗纤维化的又一潜在靶点。

　　２.２.６　ＭicroＲＮＡ（miＲＮＡ）　是一类内生的、长度约为２０～２４个核苷酸的小ＲＮＡ，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。目前已发现多个肝纤维化相关miRNA，如miRNA－132、miRNA－156、miRNA－16、miRNA－150、miRNA－17－92、miRNA－194、miRNA－200、miRNA－335等有抗肝纤维化作用；miRNA－155、miRNA－199ａ/ｂ、miRNA－27ａ、miRNA－27ｂ、miRNA－34ａ、miRNA－122、miRNA－29等有促肝纤维化作用。随着研究的深入，将会发现更多的肝纤维化相关miRNA。

　　２.２.７　基质降解靶点　MMPs是降解ECM的主要酶，TIMPs能抑制MMP的活性，被认为是肝纤维化产生的原因之一。因此，可通过抑制TIMPs和增加MMP活性，使ECM降解增加、合成减少来治疗肝纤维化。

　　２.２.８　其他Ｔoll样受体家族与固有免疫有关，由多种进化保守的识别受体构成。TLR４在肝纤维化中作用基本阐明，该受体分子也是值得关注的抗纤维化靶点。瘦素是近年来研究较热的细胞因子，其为肥胖基因编码产物，主要由脂肪细胞表达。活化的HSCs可表达瘦素及其功能性受体，瘦素能提高TGFβ、TNFα等细胞因子的活性促进肝纤维化发展，因此瘦素可作为肝纤维化治疗一个较好的新靶点。肌纤维母细胞上表达的Ｇ蛋白藕联大麻素受体（CB）也参与肝纤维化形成。CB1促纤维化而CB2抗纤维化。CB1受体拮抗剂可减少急性肝损伤的基质重塑，促进凋亡和抑制肝脏纤维性细胞的增殖。此外TNFα也已被学者用来作为抗纤维化靶点。

　　如前所述，肝纤维化发展涉及多种细胞、多种因子、多种信号通路激活，所以在今后的研究中，除了寻找关键靶点之外，还应比较单一靶向和多靶向治疗的疗效差异。

　　3 载体选择和修饰

　　上述靶细胞和靶点分子确定后，下一步就应该构建特异、高效、低毒的靶向投递系统。其中包括选择合适的效应分子（攻击分子），然后再选择合适的载体，并对其进行修饰，最后负载效应分子。siRNA、人源化抗体、干扰素γ、反义寡核苷酸以及其他化学药物［如霉酚酸、己酮可可碱、18β－甘草次酸、格列威衍生物PAP－19、Rho激酶抑制剂（Ｙ27632）、多柔比星、胶霉毒素、白细胞介素－10、氯沙坦、15ｄ－前列腺素J2等均可作为效应分子，可以根据实际情况取舍。新型靶向给药载体种类很多，包括脂质体、乳剂、微球、纳米粒（聚乙烯亚胺纳米粒、磁性纳米粒等）、纳米囊、胶束、红细胞载体以及前体药物、单克隆抗体等。入血的靶向药物应有足够长的循环时间，若被快速清除则难以发挥治疗效果。经研究，亲水性聚合物聚乙二醇（PEG）是应用最广泛的长循环修饰材料，并已获得美国食品及药物管理局（FDA）的批准。目前，PEG化修饰已经成为人们公认的实现载体靶向给药的一个先决条件。

　　３.１　载体选择和修饰的一般原则　载体选择和修饰绝非易事，必须符合下述要求，方有可能进入临床应用。（1）靶受体特异表达。（2）药物载体与受体亲和力高。（3）靶细胞上受体密度高。（4）载药颗粒血清中稳定性好。（5）活性物质在胞内释放：内吞及胞内分离是必要的。这就要求药物与载体间适当连接，药物本身不至于在内吞过程中被破坏或释放于胞外。（6）载体结合足够量的药物。（7）载药复合体低免疫原性。（8）载药复合体大小适中，既不会被肾脏很快清除，又能够穿透至病变组织。（9）低毒、给药方便、生物半衰期适中，以便于长期用药。（10）合成简单，符合药品生产质量管理规范（GMP）标准。

　　３.２　常用的载体修饰方法

　　３.２.１　靶标１：活化的肝星状细胞/肌纤维母细胞　用蛋白/多肽/糖类靶向性分子修饰载体。（1）环肽RGD修饰载体可靶向作用于细胞表面Ⅳ型胶原受体。（2）环肽ｐＰＢ修饰载体能结合到细胞表面ＰＤＧＦβ受体。有报道用环肽ｐＰＢ修饰脂质体包裹干扰素γ，可特异作用于HSCs，抑制其增殖、活化，促进凋亡。（3）甘露糖－６－磷酸修饰载体可作用于细胞表面甘露糖－６－磷酸－胰岛素样生长因子Ⅱ受体（M6P/IGFⅡ）；HSCs活化后其胞膜上M6P/IGFⅡ受体表达增加。曾有报道把M6P连接到人血清白蛋白（HSA）上以构建M6P－HSA，用其包裹某些药物可达到靶向治疗肝纤维化的目的。

　　蛋白修饰病毒载体。带有PDGF-β结合蛋白的修饰病毒或腺病毒，转染HSCs，可作用于特异性启动子和基因。神经生长因子修饰的腺病毒载体可与HSCs表面p75神经营养因子受体结合。

　　其他。人源抗突触素单链抗体（C1－3ScAb）修饰载体可与HSCs表面突触素受体结合。VitA修饰的阳离子脂质体可与HSCs表面VitA受体结合。

　　３.２.２　靶标２：枯否细胞和窦内皮细胞　甘露糖修饰载体可靶向作用于枯否细胞（M2巨噬细胞）表面的CD206分子；海藻糖残基修饰载体可靶向作用于枯否细胞海藻糖受体；琥珀酰化/乌头酰化蛋白修饰载体可靶向作用于窦内皮细胞和/或枯否细胞相关分子；透明质酸修饰载体可靶向至窦内皮细胞上透明质酸受体CD44；纳米颗粒－吸附性胞饮可达到非受体介导的高分子量颗粒摄入。如氯膦酸脂质体可作用于枯否细胞。

　　３.２.３　靶标３：肝细胞　肝细胞表面有丰富的去唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R），能与有半乳糖末端的去唾液酸糖蛋白结合，对纳米载体进行半乳糖改性修饰，可使其具有肝细胞靶向性。甘草酸/甘草次酸受体介导的肝细胞靶向给药系统也有较多研究报道。此外腺病毒或与之相关的病毒载体可结合到肝细胞表面柯萨奇病毒和腺病毒受体或CD46分子。

　　３.２.４　靶标４：活化的胆管上皮细胞/肝祖细胞　RGD类似物可靶向作用于胞膜整合素αⅴβ６；胰泌素修饰载体可靶向作用于胆管上皮细胞/肝祖细胞胰泌素受体。

　　４　疗效和毒副作用检测

　　肝纤维化靶向治疗是否有效不仅要看细胞培养和动物模型的研究结果，而更要看临床患者使用效果。疗效检测指标应包括肝脏组织细胞形态、胶原免疫组化染色、肝组织匀浆羟脯氨酸含量测定、肝组织天狼星红染色结合图像分析测纤维化水平以及肝功能改善相关指标的检测等；小动物活体成像和临床影像学检查亦有重要帮助。毒副作用检测须结合传统的毒理学方法和病理形态学方法了解全身各器官形态和功能变化，同时要利用培养细胞对新材料的细胞毒理学进行细致观察，深入探究其作用原理和可能危害。

　　肝纤维化靶向治疗寄托了太多的理想和期待，尽管前人已取得显著进步，但由于病变的复杂性，如何把握治疗的时机、如何选择靶点、如何选择载体以及如何选择效应分子，乃至给药途径等一系列问题，仍然须要进一步探索，尽可能找出最佳方案。

　　临床肝胆病杂志 第29卷第11期2013年11月