树突状细胞疫苗及其在抗HBV/HCV免疫中作用

　　王全楚 冯志华 聂青和 周永兴

　　西安第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心 710038

　　树突状细胞(DC)是目前发现的功能最强的专职抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APC），在免疫反应中起着举足轻重的作用，因此备受重视。20世纪90年代以来，人们在体外诱导扩增DC成功之后，克服了以往由于DC在组织中含量很少、难以获取的困难，使DC研究取得了许多突破性的进展，为人们探索新的疾病防治手段开辟了新的天地。现从树突状细胞的特性、体外诱生及以DC为基础的治疗性疫苗在抗HBV/HCV感染中的作用等3个方面作一综述。

　　一、DC的特性和功能

　　树突状细胞最先由Steinman和Cohn在1973年描述。在不同情况下DC形态不同。皮肤及淋巴结中DC是星形的；分离后负载于玻片上的DC有许多树刺状突起；电镜下的DC多呈棘状：相差显微镜下DC的胞体向外延伸成幔状。Steinman［1］阐述了DC与功能相关的几大特性：（1）DC具有捕获加工处理抗原的能力；(2)DC高表达MHCⅡ类产物（＞106／细胞）；(3)DC表达丰富的粘附分于及共刺激因子，如ICAM、LFA3、整合素、B7、CD40和IL12等，这涉及到DC与T细胞的结合及归巢倾向（但这些表面标志随DC的不同分化阶段而有变化）；（4）DC具有显著区别于其它细胞的表面标志。活化的DC不表达T细胞、B细胞和单核／巨噬细胞的典型表面标志，却表达CD83、SI00、CD40、CD80、CD86、CD1a、CD11a、CD45、HLAABC和HLADR、HLADQ［2］等。

　　DC具有异质性，有人将其分为髓系和淋巴系两大类，但至今仍无非常明确的分类标准。不同的DC担负着不同的使命。胸腺髓质中的DC参与胸腺中的阴性选择，它递呈自身抗原与MHC的复合物给T细胞，然后使能够识别自身抗原并与之有较高亲合力的T细胞克隆失能。髓系DC对T细胞免疫反应可产生强烈的刺激作用，并可分泌IL12，调节T细胞和NK细胞功能，促进Th0朝Th1方向分化，显著影响Th1和Th2的平衡。DC在外周性免疫耐受中也起重要作用。淋巴系DC倾向于促进Th2分化，并可递呈源自凋亡细胞的肽片段。据此，DC可通过递呈来自体细胞的自身抗原给T细胞而诱导对自身蛋白的耐受。迁移中的髓系DC，包括LC，在遭遇外源抗原后产生活性，移向淋巴器官启动免疫反应［1］。

　　DC对B细胞的生长和免疫球蛋白的分泌有重要作用。两者虽同为APC，但DC有较高MHC及共刺激因子的表达并能大量产生IL12；DC通过Fc及多聚凝集素（multilectin）受体中和抗原，B细胞则有抗原特异性免疫球蛋白受体。原始B细胞仅与间质内非郎罕型DC反应，在DC分泌的IL12作用下产生抗体；DC同时调控着B细胞所产生的免疫球蛋白的种类，IL10与TGFβ诱导IgA1的生成，IgA2的表达则严格依赖于B与DC的直接相互作用，这说明DC控制着粘膜的免疫。滤泡型DC直接维持激活B细胞的活力、生长与分化，生发中心含有CD11c+DC，它可携带免疫复合物，有较强的刺激B细胞的能力。DC与B细胞间作用方式也遵循双信号原则，即DC上的特异性抗原被BCR接受产生第一信号，DC上CR2L与B细胞上CR结合，这对共刺激因子提供第二信号调控体液免疫。

　　二、DC的体外诱生

　　体外诱生DC有许多不同的方案。骨髓、脐血和外周血干细胞、外周血单核细胞都可以作为前体来诱导分化为DC，奥地利学者甚至提出乳铁传递蛋白(Lactoferin)阳性的中性粒细胞在体外也可转型为用不同的起始细胞群诱生DC需要不同的培养条件。用CD34-细胞诱生DC时，去掉非贴壁细胞可显著降低淋巴细胞的污染。CD14+单核细胞在合适的条件下也可分化为DC［2］。表1总结了体外诱生培养DC的不同条件。

表1体外诱生培养DC的条件细胞来源

培养条件

培养基/添加剂骨髓

　　尽管用不同的前体细胞扩增DC的方法各不相同，但GMCSF似乎是必不可少的。GMCSF可诱导DC前体扩增，促使其分化，并可在体外维持DC存活达6周。IL4往往与GMCSF同时使用，特别是将外周血单个核细胞或单核细胞作为前体时。IL4可抑制巨噬细胞克隆形成，诱导DC生长和成熟。当用骨髓或脐血CD34+细胞作前体时，则用TNFα代替IL4。TNFα可降低粒细胞的产生，上调细胞GMCSFβ链的表达，增强其对细胞因子信号的反应能力。许多其他细胞因子也被证明对DC的产生具有促进作用如［46］，如IL13,SCF,TGFβ1等。有报道，向用GMCSF、TNFα和IL4刺激的骨髓CD34+细胞培养体系中加入Flt3配体可使DC的收获率提高5倍，再加入SCF可进一步提高。持续的流动灌注培养体系可进一步增强DC的扩增。甲胎蛋白对DC可产生抑制作用，下调共刺激分子的表达：IL10可以抑制OC的分化，将未成熟DC转化为可诱导产生耐受的APC，这也许可成为治疗自身免疫性疾病和过敏性疾病的有效方法。LPS、PGE2、含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(CpG motif containing oligonucleotides,CpGODN)等免疫调节因子可以促进DC成熟从而增强抗原提呈功能。不同的前体细胞，不同的细胞因子和培养条件可以改变DC的表型和功能。GMCSF和IL4有利于髓系DC分化，而IL3促进向淋巴系DC分化，CD40L则对两种DC的成熟都有促进作用［2］。

　　虽然目前已有的方法可以扩增出一定数量的DC，但不足之处是方法复杂，所需细胞因子的量较大，培养时间长，成本高，所以，DC大量扩增方法学的优化也是下一步研究的关键问题。

　　三、DC在HBV／HCV发病机制中的作用

　　近年来，越来越多的证据表明，由DC激活的细胞免疫特别是CTL介导的免疫反应，在机体抵御恶性肿瘤和传染性疾病中发挥着十分重要的作用，而且最近DC疫苗的临床Ⅰ、Ⅱ期试验也取得了令人鼓舞的结果，显示出DC疫苗在恶性肿瘤等疾病中的巨大前景。

　　(一) DC在HBV发病机制中的作用一般认为，细胞免疫功能低下是HBV感染慢性化的主要原因。作为主要的抗原呈递细胞，DC的功能缺陷将直接影响T细胞的免疫反应。已有实验证实DC可诱导肿瘤细胞免疫耐受，但婴幼期免疫耐受是否与此有关尚需进一步研究。

　　Akbar等［7，8］使用HBV转基因鼠（HBVTg）模型研究PBMC来源的DC与免疫接种后应答的关系，发现疫苗接种后应答者DC功能明显强于无应答者。在另一些实验中有潜在DC功能的HBVTg经免疫接种治疗后无HBsAg和HBeAg的表达，HBV DNA滴度也较低。DC功能较差者治疗前毫无反应，两组治疗前HBsAg、HBeAg和HBV DNA浓度无差异。提示DC活化程度可作为判断免疫治疗预后的指标。

　　Shimizu等［9］研究发现，DC免疫可以打破HBVTg对CTL的免疫耐受，而且转基因鼠不能产生抗HBs只与与DC功能缺陷有关，与T、B细胞功能无关。经IFN处理后DC可上调表达MHC和T细胞抗原（KLM）。国内外学者已有报道慢性乙型肝炎患者外周血DC功能明显低下，抗原呈递不足可能是导致HBV感染慢性化的原因之一［10，11］。

　　(二) DC在HCV发病机制中的作用目前研究认为，细胞免疫可识别和清除病毒感染，因而HCV的清除起重要作用。HCV感染早期T细胞反应的强度、表位特异性和细胞因子分泌情况等很可能将决定感染的预后。HCV感染时，除病毒感染的非造血细胞外，淋巴结和骨髓来源的DC作为专职抗原提呈细胞也直接参与启动抗病毒T细胞应答［18］。

　　AuffermannGretzinger等［12］研究发现，慢性丙型肝炎患者外周血DC经同源刺激后不能分化成熟，其膜表面分子仍为未成熟型，虽能摄取抗原，但不能呈递抗原。自限性HCV感染者DC功能跟正常人一样可以分化成熟，提示DC抗原呈递能力下降可能是导致持续感染慢性化的原因之一。

　　Bain等［13］报道FCV感染者外周血DC虽然形态及摄取抗原能力正常，但刺激T细胞增殖能力较正常人明显降低。用RTPCR检测DC培养液中HCV病毒及其准种，6例中5例可检测到HCV RNA阳性。其中 1例DC中HCV RNA序列不同于血清、肝脏及其他部位，提示HCV引起的DC刺激能力下降可能由于DC本身储存病毒所致。

　　Kakumu等［14］观察HCV和HBV引起的原发性肝癌（HCC）中DC分泌IL12以及T细胞刺激能力下降。21例HCV、5例HBV所致的HCC均可见DC功能下降。Kanto等［11］发现HCV感染所致的DC功能下降可被HCV核心区抗原刺激后恢复。24例慢性丙型肝炎患者DC刺激前CD86、IFNγ表达以及T细胞刺激能力均低于正常组DC，但核心区抗原刺激后DC可持续T细胞增殖能力。

　　四、DC疫苗的制备及其在HBV/HCV抗感染免疫中的作用

　　(一) 病毒特异性抗原负载的DC疫苗为增加DC的抗原呈递功能，将病高特异性的抗原负载到DC细胞或体外致敏DC制成特异性DC疫苗或瘤纸在抗肿瘤免疫中已取得较好效果。用同样的方法治疗肝炎也取得相似结果。

　　Bohn等［15］将HBsAg致敏的DC转入H2小鼠体内，可诱导MHC限制的HBsAg特异性CTL反应。Bocher等［16］等用BALB／C小鼠全身致死性照射后植入SCID小鼠骨髓以支持快速植入PBMC制成可感染HBV或HCV的动物模型。用上述模型来研究和比较3种治疗性抗乙型肝炎疫苗：①抗原HBcAg负荷的DC疫苗；②大剂量HBcAg抗原；③编码HBcAg的DNA疫苗。实验发现，3种疫苗均诱发了强烈的针对HBc的原发性Th细胞反应，但后两种疫苗诱发了针对特异抗原靶位HBc（1827）的特异性CTL反应和特异性体液免疫反应，提示大剂量HBcAg抗原颗粒和编码HBcAg的DNA疫苗可能是更有前提的治疗性疫苗。

　　(二) 特异性抗原基因导入DC的方法由于基因转染的DC疫苗能提供更多更有效的可供识别的抗原表位，而且可以最终克服HLA限制，已成为最具发展前景，备受人们关注的研究热点。目前在基因转染DC的方法上人们已经进行了许多探索。

　　1.DNA转染DC虽然裸DNA转染DC的效率较低，但仍然有几个研究小组在不断探索。Tuting等［17］采用基因枪轰击的方法将编码HPV16E7的质粒导入鼠骨髓来源的DC，将存活的转基因DC免疫小鼠后，不仅在体内产生抗原特异性的CTL反应，而且还引起随后对致死量HPV16转化的肿瘤细胞攻击的排斥。采用电击法和脂质体介导的方法将pEGFP质粒分别导入CD34+来源的DC（PCDC）、郎汉斯细胞（PCLC）和CD34来源的DC(MoDC)。实验结果表明，脂质体介导法对3种DC几乎无效，而电击法的转染效率分别为12%PCDC，16%PCLC和2%MoDC。

　　2.重组腺病毒介导的转染近年来的研究表明，重组腺病毒介导的转染效率比裸DNA转染DC的效率高。Wan等［18］研究显示，90％的鼠骨髓来源的DC能有效转染Ad(γgal),但Dietz等［19］研究发现，直接用AdRSVGFP转染人外周血DC，只有大约20%的DC表达GFP，采用AdRSVGFP和脂质体后，转染效率可高达90%，说明脂质体可以增强腺病毒介导的基因转染DC的效率。使用腺病毒载体作为基因转移载体来制备疫苗，遇到的主要问题是病毒本身基因的表达成为潜在的免疫原，但动物实验表明，反复注射病毒转染的DC，仅仅产生低滴度的中和抗体。Mulders等［20］利用适度的紫外线照射重组腺病毒，既不改变腺病毒结合受体的结构和进入细胞的能力，又能封闭腺病毒本身基因的转录，随后用Poly（Llysine）共价结合紫外线照射得到的腺病毒，结果高效地将外源基因转入DC，且没有共存的腺病毒基因的表达，这为DC疫苗的制备提供了一种更加安全的方法。

　　3.逆转录病毒介导的基因转染腺病毒作为基因转移载体的主要限制是不能将被转移的外源基因整合到转染细胞的基因组中去，这样1～4周后，外源基因将失去表达，逆转录病毒却能将被转移的外源基因整合到转染细胞的基因组中去，从而外源基因将得到有效和稳定的表达。目前，一些实验已证明，利用逆转录病毒将TSA基因导人鼠和人的DC是可行的。如用MFG逆转录病毒系统将LacZ基因转入人外周血DC,7d后，35%～67%的DC显示出较高的βgal活性，20d后PCR依然能检测出LacZ基因的存在，表明LacZ基因已稳定整合于DC基因组中。另外，逆转录病毒转染的DC依旧保持着DC的生物学特性，并能诱导产生抗原特异的CTL。

　　4.重组痘病毒介导的基因转染DC重组痘病毒介导TSA基因转染DC具有如下特点：转染率高；TSA基因高表达；TSA基因进入DC后基因表达快；免疫接种前，转染的DC所需培养时间短。重组痘病毒转染的DC也能产生抗原特异性CTL。Kim等［21］发现重组痘病毒介导的黑色素瘤相关抗原基因MART1转染DC后，接种于黑色素瘤患者，结果在体内产生MART1特异性的CTL反应，显示出重组痘病毒在制备DC疫苗上的巨大潜力。

　　(三) DNA疫苗直接转染DC尽管DNA疫苗仅能直接转染较少一部分的DC，但是实验已发现在引流淋巴结的DC被广泛激活，从而为效应细胞的活化提供了最佳的条件，因此DNA疫苗若以DC为载体，能得到良好的免疫效果。

　　五、问题与展望

　　树突状细胞系统作为机体内免疫反应的始动手和调节子，具有激活CD8+ CTL CD4+T辅助细胞的能力，控制着体内免疫反应的过程，因而它已成为抗肿瘤和抗病毒免疫反应的中心环节。近年来，有关DC系统及其抗肿瘤疫苗的实验研究取得了显著的进展，促进了DC疫苗在部分肿瘤病人体内的Ⅰ，Ⅱ期临床研究的深入，但是在抗病毒免疫方面尤其是抗肝炎病毒的免疫治疗方面尚处于开始阶段。随着DC研究的深入，体外获得大量的DC和制备DC疫苗的技术日趋成熟，特别是可以针对每个患者制备特异的DC疫苗，从而进行特定的免疫学治疗。相信上述DC疫苗在不久的将来可能成为病毒性肝炎临床治疗的一种不可缺的辅助手段。