肝纤维化的基因治疗研究进展

　　解放军三零二医院传染病研究所基因治疗研究中心 成军

　　 肝纤维化的形成是多种因素参与并长期相互作用的过程，因此肝纤维化的基因治疗也应采取综合措施。

　　 阻断转化生长因子信号转导途径

　　 转化生长因子β（TGF β）是肝纤维化形成过程中最重要的细胞因子之一。TGF β通过自分泌和旁分泌方式，对细胞的分裂增殖具有促进或抑制双重作用，是目前与肝纤维化相关的肝脏贮脂细胞(又称肝星状细胞)重要的细胞调节因子。TGF β能够调节肝脏贮脂细胞的基因表达类型和表达水平，对激活肝脏贮脂细胞并使其向纤维母细胞转化、合成大量的细胞外基质、通过产生基质金属蛋白酶（MMp）降解细胞外基质有重要影响。

　　 体外研究发现，TGF β能够激活肝脏贮脂细胞，并提高肝脏贮脂细胞I、II、III型胶原、纤维连接蛋白、波状蛋白（undu1in）和蛋白聚糖等的表达。TGF β可以促进静止肝脏贮脂细胞的转化，但抑制肝脏贮脂细胞的增殖。TGF β的信号转导首先是通过靶细胞膜上的特异性受体而介导的。构建表达缺失突变型的II型TGF β受体的腺病毒载体，该腺病毒载体与靶细胞膜上天然受体竞争性结合TGF β，可以阻断TGF β的生物学功能。

　　 在动物实验中，通过门脉系统给大鼠模型注射重组腺病毒，以确保在肝脏中表达这种截短型TGF β受体分子。结果显示，接受重组腺病毒组大鼠肝脏的纤维化程度、I型胶原、纤维连接蛋白、α平滑肌肌动蛋白（α－SMA）、TGF β和单核－巨噬细胞的数量都显著减少，这种抑制作用在肝组织的各个部位都可以观察到。该研究显示，通过阻断TGF β II型受体，肝脏贮脂细胞和枯否细胞的激活受到抑制，从而十分有效地阻断肝纤维化进程，肝脏功能的改善也十分明显。

　　 促进肝细胞再生

　　 在肝纤维化形成过程中，肝细胞的相对体积和绝对数量都显著减少。因此，剌激、促进肝细胞再生也是防治肝纤维化的重要策略和措施。能够促进肝细胞再生的因子包括多种生长因子，如肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）、TGF α、角质细胞生长因子（KGF）和肝再生增强因子（ALR）等。HGF是促进肝细胞再生最强的生长因子之一。缺失变异型HGF具有比完整HGF分子更强的有丝分裂原作用。

　　 通过构建表达这种缺失突变型HGF的载体，可以检验HGF在防治二甲基亚硝胺（DMN）诱导的肝纤维化进程中的作用。研究显示，缺失突变型HGF可明显抑制肝纤维化，主要机制是降低或抑制TGF β基因转录水平和肝脏贮脂细胞的激活以及促进肝细胞再生。缺失突变型HGF甚至对DMN诱导已经形成的肝纤维化也具有显著的抗肝纤维化作用。

　　 HGF不仅可以剌激肝细胞再生，而且还有助于纤维化肝脏组织结构的重新构建。另外，HGF还具有促进新的血管形成的作用。HGF促进转录调节因子ets的表达，这种转录因子上调胶原酶I、尿激酶原基因的表达，促进细胞外基质的降解。也是HGF抗肝纤维化的重要机制。

　　 另外一种促进肝细胞再生的生长因子是作为肝剌激物质（HSS）主要有效成分的ALR。研究表明，ALR通过上调γ干扰素的表达，抑制自然杀伤（NK）细胞的活性，去除抑制肝再生的因素，达到促进肝再生，逆转肝纤维化的目的。

　　 抑制间质炎症

　　 间质炎症是肝纤维化病理改变的一个重要特征，同时也是肝纤维化的重要中间环节。因此，抑制间质炎症反应也是肝纤维化基因治疗的重要策略。白细胞介素10（IL－10）是肝纤维化间质炎症的重要炎症介质因子，因而是阻断肝纤维化过程基因治疗的重要靶位点。重组IL－10显著抑制体外培养的枯否细胞产生超氧化物离子和肿瘤坏死因子α（TNF α）。

　　 IL－10在肝纤维化中的抑制作用首先在胶原基因启动子活性的下调结果中得到证实。另外的研究证实，肝脏贮脂细胞表达IL－10水平下降，可能是肝纤维化形成的重要原因。

　　 促进肝脏贮脂细胞凋亡

　　 过去二十年间，关于肝纤维化的细胞生物学和分子生物学机制研究取得了显著进展。其中关注的焦点就是肝脏贮脂细胞的激活与转化。肝脏贮脂细胞的激活具备一系列特征，包括细胞外基质合成水平增加，获得收缩功能，晚期肝脏疾病中造成肝脏组织结构的显著改变。肝脏贮脂细胞的激活和转化是由多种因素参与的、复杂的途径和机制。肝脏组织中的细胞外基质总量也是处于动态变化之中，所以肝纤维化的发展历程取决于细胞外基质代谢状况，即肝脏组织中细胞外基质的合成和降解速度的净值。因此，抗肝纤维化的基因治疗也得根据肝纤维化形成的分子生物学机制从多个方面进行，最为有效的抗肝纤维化基因治疗还是针对肝脏贮脂细胞的基因治疗途径。

　　 肝脏贮脂细胞是肝纤维化时产生细胞外基质的主要细胞类型。从肝脏贮脂细胞绝对数量来说，肝纤维化可以理解为肝脏贮脂细胞的细胞凋亡过程受到了抑制，从而加强了肝脏贮脂细胞的激活与转化。细胞凋亡和细胞增殖是一对矛盾，相互依存。对肝脏贮脂细胞表达的细胞凋亡抑制基因bcl－2和bcl－xl的水平进行半定量测定，发现早期的肝脏贮脂细胞表达水平显著高于晚期培养的肝脏贮脂细胞以及转化而成的成纤维细胞。因此，从肝脏贮脂细胞的细胞凋亡入手，也是探索肝脏贮脂细胞凋亡为基础的肝纤维化基因治疗的新途径。

　　 端粒酶与肝纤维化的基因治疗

　　 端粒是真核细胞染色体末端特殊的帽状结构。当端粒的长度低于24kb这一临界值时，染色体的稳定性和完整性就难以维持。端粒长度的维持主要依赖端粒酶的活性。大量证据表明，端粒酶在调节细胞周期、细胞衰老、细胞增殖、细胞转化以及肿瘤形成过程中具有重要作用。

　　 由血清白蛋白启动子指导的尿激酶纤溶酶原激活剂（tPA）基因的转基因小鼠，在出生时发现有广泛的肝细胞坏死，甚至出现肝功能衰竭。对异常肝细胞的端粒长度进行研究发现，第一代至第三代转基因小鼠的外周血淋巴细胞的端粒呈现进行性缩短。肝脏中处于细胞凋亡状态的肝细胞增加了3．6倍。提示端粒和端粒酶系统是关系到肝细胞生存与凋亡状态的关键因素。流式细胞学研究结果表明，端粒酶活性异常，可以抑制肝细胞的有丝分裂过程。当这种第六代转基因小鼠以表达端粒酶的腺病毒载体进行基因治疗时，治疗组小鼠腹水消失，体重增加，血清丙氨酸氨基转移酶水平下降，肝细胞增殖活性升高。提示通过表达端粒酶的基因治疗是慢性肝脏疾病包括肝纤维化基因治疗的重要途径。

　　 责任编辑 郑桂香

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