拉米夫定治疗相关的乙型肝炎病毒变异研究进展

文章编号：1007-3418(2002)03-0238-03

崔儒涛 王宝恩 张福奎 尹珊珊
【关键词】 肝炎病毒，乙型； 病毒变异； 拉米夫定
progress in the research on the HBV mutants associeted with lamivudine therapy.
CUI Rutao, WANG Bao'en, ZHANG Fukui and YIN Shanshan.
【Key words】 Hepatitis B virus; Viral mutant; Lamivudine
【First author's address】 Liver Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China
中图分类号：R512.605 文献标识码：A

拉米夫定治疗相关HBV变异多发生于活性最强、包含第546～575位氨基酸的C区段酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸（YMDD）位点，亦涉及第501～545位氨基酸的B区段。YMDD位点是HBV逆转录酶的活性部分，属高度保守序列。在HBV的逆转录过程中，YMDD位点中的YM能与模板核苷末端的糖基相作用，影响寡核苷酸与模板链的结合。YMDD变异是第552位蛋氨酸（M）被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）所取代，变成M552V与M552I[1]。两者可单独存在，M552V亦可与B区段第528位亮氨酸（L）为蛋氨酸（M）所取代的变异同时发生，形成L528M[2]。以往，一般将该变异称为YMDD变异，YMDD变异命名的不足在于：在抗病毒治疗中，仅M容易发生改变；变异为V和I所产生的后果不同；忽略了变异对HBsAg的影响[3]。新的命名体系将HBV聚合酶蛋白划分成4个区域：终蛋白区、间蛋白区、rt区和RNA酶区，每个区的氨基酸分别计算位码。rt区起始于高度保守的EDWGPC DEHG位点，包含344个氨基酸，拉米夫定治疗相关的变异主要发生在该区，包括rtL180M（即528、526、515、525位变异）和rtM204V/I（即552、550、539、549位变异）。新命名体系包括4个部分，即所属区域、治疗前氨基酸、变异位码和变异氨基酸，如rtL180M表示变异发生在rt区的180位点，亮氨酸被蛋氨酸所取代[3]。应当指出的是，发生变异不一定耐药，只有当变异株成为优势株时才发生耐药。

一、变异发生率的临床研究

1. 慢性乙型肝炎（CHB）与变异的发生：295例HBeAg 阳性的亚洲CHB患者，经拉米夫定治疗1年，15%发生HBV变异，其中11%（31/295）为野生株与变异株HBV混合感染，其余4%（12/295）为单纯变异株感染[4]。用药2年，变异发生率38%[5]。其中的13例包含1个或2个位点的变异，但仍以野生株为主；其中10例变异株代替野生株并导致慢性肝炎，3例为A529T变异，6例为L528M/M552I变异，1例先后发生A529T和L528M/M552I变异。以上研究表明，治疗过程中，不同的变异会先后出现，而且新的变异有可能代替先前的变异[6]。进行上述研究的一分中心共观察55例患者，治疗104周，32例（55%）4年变异率约67%[7]。中国大陆患者拉米夫定治疗1年变异发生率约为14.6%[8]；2年变异发生率约39.7%[9]。

前C区变异株CHB 29例HBeAg阴性的前C区变异感染的CHB患者，经拉米夫定治疗（22±7）个月后，10例（35%）出现变异，出现变异时间平均为治疗13个月，4～29个月不等；1年和2年累积变异发生率分别为10%和56%。5例变异为M552V变异，并均同时发生L528M变异；5例为M552I变异，其中2例同时发生L528M变异，1例3个月后发生L528M变异。跟踪观察10例变异患者（12±10）个月（2～32个月），5例患者HBV DNA阳性，其中3例患者ALT升高；另外5例患者中有1例发生ALT升高；全部患者均病情稳定，未发生肝功能失代偿[10]。41例HBeAg（－）/HBV DNA（＋）前C区变异感染的CHB患者，拉米夫定治疗26周和52周时，变异率分别为2%和27%；52周时，在11例变异患者中，6例为野毒株与变异株共存，5例仅检测到变异株[11]。

肝移植后HBV再感染 1996年首次报道了1例40岁白人女性肝移植后HBV患者拉米夫定治疗后发生变异并耐药。该患者肝移植术后接受拉米夫定治疗，第16周HBV DNA转为阴性，但在第28周再次转为阳性，第33周病毒水平达到最高，基因测序显示第1656位核苷由G变为T，YMDD位点发生YIDD变异[12]。8例患者移植后使用拉米夫定， 62.5%（5例）在9～20个月出现变异（平均13个月），其中2例（40%）出现肝功能衰竭[13]。32例患者中，13例移植前、15例移植后和4例在HBV复发后接受拉米夫定治疗24个月，19%出现变异，其中2例出现肝功能衰竭，未发现变异的发生与开始使用拉米夫定的时间有关[14]。8例肝移植患者使用拉米夫定治疗1年，3例出现变异[15]。同时使用免疫抑制剂的患者，变异出现相对较早，约在治疗的第4周[16]。变异的出现并不会影响肝移植的预后[17]。

2. 变异出现的可能相关因素：前瞻性研究发现，HBeAg阳性较HBeAg阴性患者变异发生率高[18]。用药前血清HBV DNA水平较高与变异的发生呈正相关[19]；治疗前HBV基因组的不同类型与变异的发生相关；疗程亦与变异的发生呈正相关；合并用药可能与变异发生有关，如肝移植后使用免疫抑制剂患者发生变异的机会增加；目前没有剂量与变异发生呈正相关的证据，两组分别接受25mg/d与100mg/d的患者其变异株的发生率无差异[3]。

二、变异的检测

主要采用基因测序的方法。用荧光标记的探针采用PCR的方法检测，与测序同样灵敏，但快速简便[20]。限制性片段长度多态性分析检测变异与测序同样灵敏，但操作简便，适用于大规模临床检验使用[21]。

三、变异发生的机制研究

1.拉米夫定导致变异的发生：发生变异的病毒株，其异柠檬酸和缬氨酸亚基可阻止拉米夫定与多聚酶的结合，从而结合dCTP而不结合拉米夫定，使DNA链能继续合成。在使用拉米夫定治疗期间，如果出现转氨酶的异常波动，多提示变异的发生。变异发生后，机体对变异株的识别激发免疫清除机制，导致转氨酶波动并有可能阻止变异株的复制，进而有可能发生HBeAg的血清转换。使用拉米夫定导致的机体重建抗HBV免疫反应也是其该药的作用机制[22]。

2.YMDD自然存在或发生：检测18例未使用拉米夫定等核苷类药物和干扰素治疗经历的无症状的HBV感染者，全部患者HBeAg阳性，其中3例发现YMDD＋YIDD变异，2例发现YMDD＋YVDD＋YIDD变异，证明YMDD变异在无症状的HBV感染者中自然发生[23]。HBV感染的肾移植和透析患者在拉米夫定治疗前后均可以检测出YMDD变异的存在[24]。上述研究显示，YMDD变异株可能是自然存在的，经拉米夫定药物筛选后，出现YMDD变异株的优势生长。

四、变异发生对治疗的影响与对策

变异出现并不是停止治疗的指标[25]。32例YMDD变异患者继续使用拉米夫定治疗，30例（93.7%）出现转氨酶升高，13例（40.6%）出现急性加重，高于服用该药无YMDD变异者的4.3%。HBV DNA水平与急性加重的发生呈正相关，HBV DNA水平在出现急性加重时达到最高，其后的1～4周转氨酶也达到最高(247～2010U/L)，其中3例患者出现肝功能失代偿，但这些患者随后出现HBeAg的血清学转换并痊愈。12例出现病毒变异的患者中，8例(75%)出现HBeAg的血清学转换，而未出现急性加重的患者未发现HBeAg的血清学转换。上述血清学转换均发生在急性加重前，提示YMDD变异株的出现，可能激发机体的免疫反应[6]。组织学研究显示，变异株出现后，拉米夫定治疗仍可改善肝脏的组织学和阻止向肝硬化的进展，为继续治疗提供了更充分的证据[26，27]。5例经拉米夫定治疗9～14个月后出现YMDD变异的患者，在停药后1～4个月内，野生株再次成为优势株，说明变异株的复制能力较弱[28]。通过对转染了YMDD变异株的肝细胞系培养发现，变异株的复制能力远低于野生株[29]。通过不同突变位点的载体，建立YMDD变异的鸭肝病毒株，其病毒酶复制活性降低，在体内外复制能力均降低[30]。观察拉米夫定治疗中HBV DNA的动态变化与YMDD出现的关系，变异的发生与病毒水平的改变无关; 治疗1年后，无应答者、YMDD变异者和未发生变异者HBV DNA阴性转换率分别为23%、40%、74% [31]。我国肝病专家制定的2000拉米夫定临床应用指导意见指出，如疑有基因变异，转氨酶仅轻度增高，在正常上限2倍以内，临床情况良好，如能测定HBV DNA定量，低于治疗前水平，可继续服药，并加强观察[32]。

阿得福韦可能对耐药患者有较好疗效。对5例变异并发生耐药患者给予口服阿得福韦5～30mg/d治疗11～15个月，结果1例发生血清转换，4例HBV DNA水平下降2lg～4lg[33]。对阿得福韦大样本、双盲、国际多中心、对照和长期疗效研究正在进行。另外，核苷类似物的联合应用是提高疗效和减缓变异产生的主要途径，但对联合使用核苷类似物抗HBV的疗效、不良反应及药物经济学的综合评价，不同研究结论不同[34]。

参 考 文 献

[1]Ling R, Harrison TJ. Functional analysis of mutations conferring lami- vudine resistance on hepatitis B virus. J Gen Virol, 1999, 80: 601-606.
[2]Gutfreund KS, Williams M, George R, et al. Genotypic succession of mutations of the hepatitis B virus polymerase associated with lamivudine resistance. J Hepatol, 2000, 33: 469-475.
[3]Stuyver LJ, Locarnin SA, Lok A, et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutation in the polymerase region. Hepatology, 2001, 33: 751-757.
[4]Lai CL, Chien RN, Leung NW, et al. A one-year trial of lamivudine for chronic hepatitis B. N Engl J Med, 1998, 339: 61-68.
[5]Liaw YF, Leung NW, Chang TT, et al. Effects of extended lamivudine therapy in Asian patients with chronic hepatitis B. Gastroenterology, 2000, 119: 172- 180.
[6]Yeh CT, Chien RN, Chu CM, et al. Clearance of the original hepatitis B virus YMDD-motif mutants with emergence of distinct lamivudine-resistant mutants during prolonged lamivudine therapy. Hepatology, 2000, 31: 1318-1326.
[7]Liaw YF, Chien RN, Yeh CT,et al.Acute exacerbation and hepatitis B virus clearance after emergence of YMDD motif mutation during lamivudine therapy. Hepatology, 1999, 30: 567-572.
[8]姚光弼, 王宝恩, 崔振宇, 等. 拉米夫定治疗乙型肝炎的长期疗效. 中华肝脏病杂志, 1999, 7: 80-83.Yao GB, Wang BE, Cui ZY, et al. Long-term effect of lamivudine treatment in chronic hepatitis B virus infection. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 1999, 7: 80-83.
[9]马红, 尤红, 尹珊珊 等. 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎2年的临床疗效. 中华实验与临床病毒学杂志, 2001, 15： 147-149.Ma H, You H, Yin SS, et al. Clinical effect of two-year lamivudine treatment in chronic hepatitis B virus infection. Zhonghua Shiyan Yu Bingduxue Zazhi, 2001, 15: 147-149.
[10]Lok ASF, Hussain M, Cursano C, et al. Evolution of hepatitis B virus poly- merase gene mutions in hepatitis B e antigen- negative patients receiving lamivudine therapy. Hepatology, 2000, 32: 1145-1153.
[11]Tassopoulos NC, Volpes R, Pastore G, et al. Efficacy of lamivudine in patients with hepatitis B e antigen- negative/hepatitis B virus DNA-positive (precore mutant) chronic hepatitis B. Lamivudine Precore Mutant Study Group. Hepatology, 1999, 29: 889-896.
[12]Tipples GA, Ma MM, Fischer KP, et al. Mutation in HBV RNA-dependent DNA polymerase confers resis- tance to lamivudine in vivo. Hepatology, 1996, 24: 714-717.
[13]Ben-Ari Z, Mor E, Shapira Z,et al.Long-term experience with lamivudine therapy for hepatitis B virus infection after liver transplantation. Liver Transpl, 2001, 7: 113-117.
[14]Malkan G, Cattral MS, Humar A,et al.Lamivudine for hepatitis B in liver transplantation: a single-center ex-perience. Transplantation, 2000, 69: 1403-1407.
[15]Seta T, Yokosuka O, Imazeki F, et al. Emergence of YMDD motif mutants of hepatitis B virus during lamivudine treatment of immunocompetent type B hepatitis patients. J Med Virol, 2000, 60: 8-16.
[16]Honkoop P, Niesters HG, de Man RA, et al. Lamivudine resistance in immunocompetent chronic hepatitis B. Incidence and patterns. Hepatology, 1997, 26: 1393-1395.
[17]Saab S, Kim M, Wright TL, Successful orthotopic liver transplantation for lamivudine-associated YMDD mutant hepatitis B virus. Gastroenterology, 2000, 119: 1382-1384.
[18]Da Silva LC, da-Fonseca LE, Carrilho FJ,et al. Predictive factors for response to lamivudine in chronic hepatitis B. Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 2000, 42: 189-196.
[19]Santantonio T, Volpes R, Pastore G, et al. Efficacy of lamivudine in patients with hepatitis B e antigen-negative/hepatitis B virus DNA-positive (precore mutant) chronic hepatitis B. Lamivudine Precore Mutant Study Group. Hepatology, 1999, 29: 889-896.
[20]Whalley SA, Brown D, Teo CG, et al. Monitoring the emergence of hepatitis b virus polymerase gene variants during lamivudine therapy using the lightcycler. J Clin Microbiol, 2001, 39: 1456-1459
[21]Jardi R, Buti M, Rodriguez-Frias F, et al. Rapid detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus polymerase gene variants. J Virol Methods, 1999, 83: 181-187.
[22]Doo E, Liang TJ. Molecular anatomy and pathophysiologic implications of drug resistance in hepatitis B virus infection. Gastroenterology, 2001, 120: 1000-1008.
[23]Kobayashi S, Ide T, Sata M. Detection of YMDD motif mutations in some lamivudine-untreated asymptomatic hepatitis B virus carriers. J Hepatology, 2001, 34: 584-586.
[24]Fontaine H, Thiers V, Chretien Y, et al. HBV genotypic resistance to lamivudine in kidney recipients and hemodialyzed patients. Transplantation, 2000, 27: 2090-2094.
[25]Lai CL, Yuen MF. Profound suppression of hepatitis B virus replication with lamivudine. J Med Virol, 2000, 61: 367-373.
[26]Dixon JS, Boehme RE. Lamivudine for the treatment of chronic hepatitis B. Acta Gastroenterol Belg, 2000, 63: 348-356.
[27]Leung N. Liver disease-significant improvement with lamivudine. J Med Virol, 2000, 61: 380-385.
[28]Chayama K, Suzuki Y, Kobayashi M, et al. Emergence and takeover of YMDD motif mutant hepatitis B virus during long-term lamivudine therapy and re-takeover by wild type after cessation of therapy. Hepatology, 1998, 27: 1711-1716.
[29]Melegari M, Scaglioni PP, Wands JR. Hepatitis B virus mutants associated with 3TC and famciclovir adminis- tration are replication defective. Hepa-tology, 1998, 27: 628-633.
[30]Seigneres B, Aguesse-Germon S, Pichoud C, et al. Duck hepatitis B virus polymerase gene mutants associated with resistance to lamivudine have a decreased replication capacity in vitro and in vivo. J Hepatol, 2001, 34: 114-122
[31]Buti M, Sanchez F, Cotrina M, et al.Quantitative hepatitis B virus DNA testing for the early prediction of the maintenance of response during lamivudine therapy in patients with chronic hepatitis B. J Infect Dis, 2001 183: 1277-1280
[32]拉米夫定临床应用专家指导小组. 2000年拉米夫定临床应用指导意见. 中华肝脏病杂志, 2000, 8: 248-249.
Guiding Group for Lamivudine Clinical Practice. Guidline for clinical use of lamivudine in 2000. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2000, 8: 248-249.
[33]Perrillo R, Schiff E, Yoshida E, et al. Adefovir dipivoxil for the treatment of lamivudine-resistant hepatitis B mutants. Hepatology, 2000, 32: 129-134.
[34]Malik AH, Lee WM. Chronic hepatitis B virus infection: treatment strategies for the next millennium. Ann Intern Med, 2000, 132: 723-731.

收稿日期：2001-06-22
本文编辑：金生
作者单位：100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心 作者简介：崔儒涛 男，29岁，博士后，发表论文34篇，SCI收录3篇。