乙型肝炎的抗病毒治疗

　　乙型肝炎为我国常见多发病，目前尚无理想的治疗方法，因此拟就目前正在使用或正在研究的抗乙型肝炎病毒的药物，结合药物作用机理及疗效进一步探讨，或许对今后临床治疗及科学研究有所裨益。

　　一、背景

　　我们必须从两个方面进行探讨，一为乙型肝炎病毒作为治疗靶子的特点，一为肝细胞在免疫应答中的作用，它不仅参与免疫调节，而且具有一定免疫应答功能。

　　1. 乙型肝炎病毒(HBV)： HBV复制模式在一定程度上和逆转录病毒相似，但又有很多重要的区别。大致可以分为4个步骤：

　　第一步为将部分双链或松弛环状DNA在细胞核内转变成为共价紧密环状DNA(cccDNA)。

　　在这个步骤中包括在负链的5'端去除未端蛋白，去除正链的寡糖核苷酸引物及去除负链终端丰余部分，完成正链的合成及双链DNA的连接。由松弛环状DNA转变成为cccDNA的机理尚不完全清楚。

　　第二步为cccDNA的负链通过RNA多聚酶Ⅱ的作用转录成信使RNA，其中最大的mRNA（前基因组）可以作为RNA模板逆转录成为病毒DNA的负链。前基因组较基因DNA模板多200个碱基对，可以和病毒多聚酶一起装配入病毒核心颗粒内。病毒多聚酶蛋白具有多种功能，病毒多聚酶的N端蛋白具有引发负链DNA的合成，病毒多聚酶还具有逆转录酶、DNA聚合酶及RNA酶H的功能。

　　第三步为病毒负链DNA合成，合成起始于DR1和DR2重复出现的11个核苷酸序列，DR1位于负链的5"端，而DR2位于正链的5'端，所有嗜肝病毒的起始核苷酸和终未蛋白结合部们均为2'-脱氧鸟苷酸。由逆转录酶合成负链DNA，而RNA酶H伴随DNA合成过程中降解RNA模板。最后一步为合成正链，其引物为RNA酶H降解模板残余的寡核苷酸片段。

　　针对HBV侵入及复制的各个环节均可成为靶因子。HBV侵入肝细胞的特异受体尚未完全清楚，目前认为可能为Annexinv。前S2区可能和受体结合有关；针对前S2120-150氨基酸合成肽的抗体具有中和作用，但是肯定这不是唯一的受体，因为小S制备的疫苗也可以产生中和抗体。病毒侵入后，从rcDNA到cccDNA，所经过的系列步者不大清楚，cccDNA形成和旋转酶(topoismerase)有关，后者可以作为治疗的靶位之一，实际上它是宿主的酶，在实验室内对喹喏酮类药物敏感，临床试用并未见效果。

　　目前注意力比较集中的靶子是病毒聚合酶， 首先是其终端蛋白可以引发负链 DNA合成，而我们真核细胞是不需要蛋白引发DNA合成的。2'3'双脱氧嘌呤类抑制DHBV合成有效，2'3'双脱氧嘧啶类无效。前者作用强的药物是2'3'双脱氧鸟苷。但是它不能抑制前基因组的形成。

　　其次为核酸类似物，包括嘌呤及嘧啶类，目前正在临床试用的Lamivudine等，可以暂时抑制病毒复制，认为其三磷酸衍生物可以抑制病毒逆转录酶的作用。无环鸟苷体外可以抑制人及土拔鼠HBVDNA聚酶的作用。人细胞DNA多聚酶a则不受上述药物抑制。上述药物多仅一过性效果，可能和cccDNA持续存在的游离基因引起的复发有关。

　　此外，降解病毒的mRNA，包括病毒的前基因组，如干扰素激活的抗病毒蛋白，2'5寡腺苷酸合成酶E等。

　　2. 肝细胞清除病毒的能力： 长期以来，人们早已认识肝细胞在免疫调节中的作用，肝细胞产生很多免疫调节因子，如E玫瑰花抑制因子，免疫抑制因子，干扰素形成抑制因子等，在机体免疫网络中维持内环境的稳定起了很重要的作用。近来我们发现肝细胞本身就具有一定免疫应答功能和免疫清除功能，如丙型肝炎病毒肝内病毒含量远远低于外周血细胞，可能和肝细胞的免疫清除功能有一定关系。

　　目前已知，肝细胞和一些T细胞相似，肝细胞内同时表达TNF及TNF受体，FAS及FAS配体，而且和肝细胞凋亡、坏死及清除病毒均有一定关系。肝细胞的凋亡或坏死可以通过三种形式，包括邻接细胞相互作用，细胞内自杀及通过释放可溶性FASL而诱导其它肝细胞凋亡，这或许可以解释肝细胞大量坏死及凋亡的原因。至于TNF的作用和FAS有所不同，FAS-L可以在数小时内引起细胞死亡，而TNF则需数日，认为TNF通过TNFR1和MORT1/FADD联系，其中还有很多未知步骤，TNFR1不但可以激活ICE家族导致凋亡，也要以经过另外信息通路，如通过TNFR1及TNFR2、TRADD、激活NF-kb基因，形成炎症。两条途径都要通过TRADD以后再分道扬镖。TNFR2主要通过和TRAF1及TRAF2激活NFkb，但在有些细胞也可引起坏死凋亡。如当肝叶切除后，TNFa可以增强加强子结合蛋白(C/EBPb及g)的活力，可以促进肝细胞基因的表达，有利于肝细胞的再生。TNF在细胞中不同的反应途径，可以和细胞本身状态有关，有人认为取决于TRAFs(抑制凋亡因子)水平，后者水平高可将TNF引导进入NF-kb基因活化通道。

　　肝细胞凋亡、坏死的清除病毒有一定关系。细胞凋亡和坏死在病理形态上有所不同，但从肝炎的病理标本中，可以发现肝细胞坏死区周围周时存在大量肝细胞凋亡。体外实验而且发现抗FAS IgM抗体可以诱致FAS阳性肝细胞凋亡，而小剂量上述抗体，仅抑制HBV复制而不引起凋亡。细胞凋亡的通路上激活FLICE等一系列蛋白酶，破坏层连蛋白，核苷酸酶进入细胞核，可以引起凋亡，如果仅激发少量ICE，也可能仅在细胞浆内裂解病毒的mRNA。目前也有人发现FAS信号在早期可以加强免疫细胞对病原体的免疫应答，对已激活的免疫细胞则引起细胞凋亡而免疫反应下降。也有人认为FAS既可以作为一个共刺激因子或死亡信号其机理尚不清楚，认为和不同第二信使有关，也可能和细胞背景不同。

　　此外，TNF有可能激活NFkb，它表达的Rel蛋白家族，和人体免疫细胞激活，T及B细胞活化，抗病毒及抗微生物反应等均有密切关系。

　　二、目前临床应用的抗HBV药物

　　1. 干扰素a及b: 为第一个抗HBV有效的药物，有关文献报导较多，我们曾用IFna 2a药物(Intron A 300万单位，隔日3个月)治疗HBsAg、HBeAg及HBVDNA均阳性慢性乙型肝炎28例，HBeAg及HBVDNA阴转11例(39.3%)，IFn a 1b 300万单位，隔日3个月治27例，阴转12例(44.4%)。

　　干扰素疗效以治疗前病情活动性高(血清转氨酶较高)，病毒含量低，女性，病程短者效果较佳。美国较大系列的研究，采用Intron A 每天500万单位，16周，HBVDNA及HBeAg阴转率为37%，对照组仅为7%。另外有人收集14组报导共800余例进行综合分析，治疗组HBeAg及HBVDNA阴转率各33%及37%。对照组仅为12%及17%。治疗组治疗结束HBsAg阴转率约为8%至12%。长期随防中，治程中病毒复制终止者65%的HBsAg转阴，常见于完成干扰素治疗3～5年以后。

　　干扰素治疗的指征：慢性肝炎转氨酶升高6个月以上，并有持续病毒复制指标(血清HBsAg、HBeAg及HBVDNA均为阴性)。

　　不适应证：包括失代倘性肝硬变，具有腹水或食道静脉曲张出血；肝脏合成功能障碍，和正常人比较，血清白蛋白降低超过3g/dL，凝血酶元时延长超过3秒，血清胆红质超过2mg/dL；其他不适应症包括脾亢，白细胞减少(<1500)，血小板减少(<75, 000)。

　　干扰素治疗的副作用，第一次注射后4～8小时出现流感样症状，其他副作用有乏力，肌痛、恶心、呕吐、体重减轻。约25%～50%病人可见白细胞减少或血小板减少。可见于用药一月后。约15%病人出现精神症状，如焦虑、忧虑、激动等。干扰素有可能激发自身免疫反应，如自身免疫性甲状腺炎。其他可能有关的疾病为血小板减少性紫癜、溶血性贫血、类风湿性关节炎、红斑狼疮样症状群、第Ⅰ型糖尿病等，停药后即消失。

　　干扰素作用的机理： 干扰素a及b主要具有抗增殖及抗病毒的功能，而干扰素g主要为免疫调节的介质，人IFna及IFnb基因主要位于第9染色体，而IFNg基因主要位于12染色体。

　　目前常用天然IFna，不是一个单一的蛋白质，至少有23个基因表达的16种以上的蛋白质。重组干扰素系采用12种IFna共同的氨基酸序列。重组干扰素根据个别氨基酸的不同可以分为rIFna2a，2b及rIFna1b。

　　IFna及b共有一个受体，由染色体21中的基因编码，受体为不等两倍体构成，一为130kb的糖蛋白，如gIFn则为-90kb的单链，由染色体6的基因编码。

　　IFna和相应受体结合后，15分钟内IFn反应基因而激活，首先激活酪氨酸蛋白激酶(JAKs)，然后对一些细胞质内蛋白质进行磷酸化，称为干扰素刺激基因因子(ISGF)3a或STAT1及STAT2。30分钟后ISGF3a进入细胞核，结合干扰素反应基因的成分(ISRE),可以激活干扰素反应基因，转录2'5'-OAS，组织相容抗原，蛋白激酶及b-2微球蛋白等。而g干扰素激活基因为GAS、ISRE和GAS有些核苷酸互相一致，但其5'端非编码区则不同。

　　IFna可以激活RNAesL，可以裂解双链病毒RNA，另外激活RNA依赖性蛋白激酶，可以对40种以上不同蛋白质磷酸化，包括2'5'OAS及EIF-2，蛋白合成抑制因子。双链RNA蛋白激酶为丝氨酸/缬氨酸特异性蛋白激酶，可以抑制病毒复制及抗增殖效应。IFna、b产生蛋白激酶作用较IFng为强。

　　IFn对很多细胞表面蛋白均可诱生，如HLAⅠ级，b2微球蛋白，HLAⅡ级(仅IFng)，补体系列成分，因子B，C2蛋白，上皮生长因子受体及Fc受体等，还可抑制胰岛素受体。

　　IFn和细胞因子级联相关，很多细胞因子和IFn作用机理相似。在应答反应中很多相同处，可以活化巨噬细胞，NK细胞及细胞毒性T细胞。

　　目前所知HBV可以减低ISGF3a的活性，尚不了解系对基因的抑制或是阻止表达。HBV多聚酶的终末蛋白可以减低IFn的抗病毒活性，减少HLAⅠ级表达及减低免疫活性细胞的活性，HBV还可抑IFnb的转录。此外，HBV的突变也可以逃脱机体的免疫反应。

　　干扰素a治疗乙型肝炎或丙型肝炎，可出现血清TNF水平升高。也有报告IL-2，IL-4，IL-10及IFng上升，IL-4，IL-10下降者则病毒易于清除。至于细胞因子水平改变，可能和干扰素作用于单核巨噬细胞系统或T细胞系统有关。

　　2. 胸腺素: 早期从White的实验室中用牛胸腺分离出的分子量为12500的多肽，称为胸腺素。后来Goldstein制备部分纯化的胸腺素组分5，含有30种以上的多肽。其中a1、a7、b3、b4具有胸腺素的生物活性，a1可以增加鼠淋巴细胞对分裂素原的反应，具有诱导协助性T细胞功能。用放射免疫法可从正常人外周血循及胸腺、肺脏的组织浸液中测出，胎儿的血浓度最高，出生后下降，迄至15岁前维持60pg/ml。胸腺素a7为一种具有高度活性的酸性多肽，可以诱导抑制性T细胞功能，并促进T细胞的标志表达。b3、b4可作用于干细胞促使其分化为前胸腺细胞。

　　目前有些胸腺成分已获得纯品，如胸腺素a1、b4、胸腺生成素及胸腺因子。胸腺素a1已经化学合成，1991年Mutchniek首先用于治疗少数乙型肝炎，取得了令人鼓舞的结果。国内13个单位联合进行胸腺素a1(Ta1)治疗乙型肝炎的临床研究，采用Ta1组96例，HBVDNA及HBeAg转阴者45例(46.9%)，Ta1加干扰素组54例，两者转阴者33例(61.1%)。采用干扰素组两者转阴率为39%。

　　我们所观察的10例，均为使用干扰素治疗无效者，其中2例采用日达仙后HBeAg及HBVDNA均转阴，6例联合IFna1b及日达仙后5例HBeAg及HBVDNA转阴，1例慢性丙型肝炎曾反复使用Infron A，或加用病毒唑均无效，加用日达仙后肝功恢复正常，HCVRNA持续转阴6个月以上。Andreone等用Ta1治疗乙型肝炎，疗程6个月，ALT复常及HBVDNA转阴为29.4%,干扰素a1组为43.8%，６月后则各为41.2%及25%。认为Ta病人易于耐受，且易 获得持续效果。Ta1抗HBV的作用机理当不完全了解，目前认为可能和增强T细胞及NK细胞应答功能及增强IL-2及IFng产生。根据我们的初步结果，不能排除Ta1直接作用肝细胞，激发肝细胞抗HBV的能力。

　　3. 核苷酸类似物： 为目前抗HBV的研究的热点，比较成熟的有下面几个药物

　　Lamivudine近二年来在美国芝加哥的美国肝病学会的年会上有较多报告多仅一过性抑制作用。Honkoop用本药每日25ng，100mg或300mg ,持续6个月治疗13 例慢性乙型肝炎，均耐受良好，治疗期间HBVDNA均已转阴，半定量PCR法测定HBVDNA由治前108降到结束时103拷贝，组织学也有显暑进步，由HAI4.4降到2.8。本文未提到随访结果。Benhamou用以治疗同时感染HBV及HIV的患者，每日600ng，继以300mg，连续一年，27例中26例的HBVDNA均降到基底线5pg/ml以下，但PCR法11.5%仍为阳性。多数为治前HBVDNA高水平患者。值得注意的是Lamivndine治程中可以出现HBVDNA多聚酶的突变，形成耐药株。RNA依赖性DNA多聚酶中有一个较保守的模块YMDD，和核苷酸连接多聚酶接触部位有关，突变为YIDD则成为Lamivudine耐药株，由第1656位核苷酸由G转为T。这个部位和HBsAg抗原基因重叠， 其系例由IWMMWYW转为IWMISYW， 对HBsAg活性的影响当不了解。

　　三、正在研究的抗HBV药物

　　反义核酸或核酶： 近年来国内外均有较多报告。反义RNA和DNA的作用形式可以分为三种：(a)和mRNA互补的核酸片断，通过硷基配对，和mRNA结合形成二聚体，破坏其翻译过程；(b)反义RNA和DNA结合，影响其复制；(c)阻止mRNA和核蛋白体的结合，降低翻译成蛋白的效率。各地选择的最佳序列各有不同。我们采用经过硫修饰，并且经过导向，取得了较好的抑制效果。最近Blum等在鸭体内进行试验，认为有较好的抑制效率。目前较大的困难为何制备价廉易实用可供临应应用反义核酸，我们实验室已取得了突破，预期不久可以获得新的结果。

　　核酶(Ribozyme)又称基因剪刀，包括三部分，一为与底物RNA上GOX(X= C, A)互补的A部分，一为由13个核苷酸组成高保守部分，为其活性部位，称为B部分。B部分两侧与靶RNA互补部分称为C，决定核酶的特异性。

　　核酶的研究多数仍保留在试管内水平，证明对HBVDNA具有一定的抑制作用。

　　作者单位：重庆医科大学肝炎研究所 简介：张定凤，男，教授，博士生导师，重庆医科大学病毒性肝炎研究所所长，《中华肝脏病杂志》总编