HBV耐药相关变异的诊断与监测

上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科 张欣欣 邓俊

HBV病毒学和免疫学诊断进展（5）

近年来，乙型肝炎病毒学和免疫学的研究水平得到了很大提高，本报《消化·肝病周刊》特别邀请上海交通大学医学院瑞金医院感染科陆志檬教授担任特约主任编委，由国内专家撰稿，向读者系统介绍乙型肝炎病毒（HBV）病毒学和免疫学诊断进展。2009 年5 月21 日D2~D3 版介绍了HBV DNA 检测、HBeAg 阴性相关乙肝病毒突变检测，6月4日D2~D3 版介绍乙肝病毒cccDNA 检测以及HBeAg 定量检测，现于本版介绍HBV 耐药相关变异的诊断与监测。

目前国内批准用于治疗慢性乙型肝炎的药物已从一种普通干扰素增加到包括聚乙二醇干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定在内的6种药物。尽管与干扰素相比，核苷（酸）类药物服用方便、副作用少，但需要长期应用且往往伴有病毒耐药风险的增加。HBV耐药及患者依从性差是导致乙型肝炎治疗失败的两个最重要原因，因此，有必要加强对HBV耐药相关变异的诊断与监测，以期最大程度地预防和减少耐药的发生。

HBV 耐药相关的定义及其临床意义

在2006年美国国立卫生研究院（NIH）的HBV工作会议上，学者们提出了对抗病毒治疗应答的标准定义。

初治无应答

初治无应答是指核苷（酸）类药物治疗6个月后，患者血清HBV DNA水平较基线下降小于1 log10 IU/ml。初治无应答可能与宿主、病毒以及药物因素有关。研究证明，治疗6～12个月后HBV DNA水平较高与病毒耐药的发生呈正相关。

病毒学突破

病毒学突破往往伴随着病毒耐药的出现，其定义为：在患者依从性良好且初治有效的情况下，连续2次相隔1个月以上的样本检测中，血清HBV DNA 水平较治疗过程中的最低点升高大于或等于1 log10 IU/ml。对伴随氨基转移酶升高的患者来说，无须证实第2次样本中血清HBV DNA水平升高。

与野生株相比，大多数HBV耐药变异株复制能力下降，所以发生病毒耐药初期，耐药HBV DNA水平比较低，但如果维持原有治疗，随着HBV代偿性变异的出现和累积，病毒的复制能力得以恢复，从而导致病毒学反弹，HBV DNA水平将会逐步增高，甚至超过治疗前的水平。

生化学突破

生化学突破是指患者获得初始应答，氨基转移酶正常后继续治疗，氨基转移酶再次升高。血清氨基转移酶可能在发生病毒学突破数周或数年后仍保持正常，生化学突破也可与病毒学反弹同时出现，某些病例出现氨基转移酶水平明显上升，提示病情恶化。

HBV耐药相关变异的诊断

　　HBV耐药相关变异的确定需要依靠实验室诊断。基因型耐药是指在药物靶基因（即HBV聚合酶基因）上出现特定的核苷酸以及相对应的氨基酸突变，且这种突变已被证明与病毒耐药有关。

　　理想状态下，为了鉴定潜在的基因型耐药，在发生病毒学突破时分离提取的HBV DNA序列及其推导的氨基酸序列应该与患者治疗前标本的序列相对比。当治疗前标本无法获得时，也可以与已经证实的同一基因型的HBV序列比较。

基因型耐药的确定基于两个方法即体外表型分析和虚拟表型分析，前者是确定基因型耐药的金标准，但需要消耗大量人力、物力和时间，后者是研究患者治疗及应答资料与HBV序列数据间相关性的一种方法，将受检表型与库中数据对比，可找到最相符的数据和最可能发生的治疗应答。
图 与核苷(酸)类似物耐药相关的乙型肝炎病毒变异位点

检测基因型耐药突变的方法

鉴定耐药突变的可用方法包括聚合酶链反应（PCR）产物的直接测序、PCR扩增产物的多重克隆序列分析、特异性探针实时PCR法、线性探针杂交法、限制性片段长度多态性(RFLP)以及最近开始应用的基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱测定法(MALDI-TOF MS)。MALDI-TOF MS法基于限制性酶切片段质量多态性(RFMP)，能检出在病毒准种中含量小于1％的突变株。

敏感的检测法能测定出在整个病毒准种中仅占5％～10％的编码耐药突变株的HBV DNA，从而能在患者发生病毒学突破时或更早时段确定基因型耐药的出现。虽然超敏测定法能检测出在病毒总体中含量低于1％的突变株，但它对于预测耐药发生的实际意义还不确定。目前，临床实践中最常用的方法包括直接测序法和线性探针测定法。

对HBV耐药的监测

对所有接受核苷（酸）类药物治疗的慢性乙型肝炎患者，治疗期间都应密切监测病毒学应答与突破，停药以后也应监测应答持续和病情复发情况。治疗开始前应该检测血清HBV DNA，治疗过程中至少每3个月检测1次。

对初治无应答的患者，应考虑替换治疗以获得临床应答，尽可能减少后续耐药。对发生病毒学突破的患者，应考虑其依从性，同时尽可能进行病毒耐药突变的检测，以确定基因型耐药的存在和病毒耐药突变的模式。目前越来越多的患者接受一种以上药物治疗，对病毒耐药突变的检测显得尤其重要。

对HBV耐药患者的治疗依赖于既往治疗史和既往疗法应答情况、病毒学突破时检测到的突变模式以及耐药突变株对不同药物敏感性的体外试验资料。最近的研究显示，与发生病毒学反弹和生化学反弹后应用补救治疗相比，在发生病毒学突破时就开始补救治疗更有效。

随着越来越多治疗方法的出现，耐药突变更加复杂，初始和补救治疗的选择也逐渐增加。因此，应该进一步规范耐药的检测方法，加强对耐药的监测，以期最大程度地预防和减少耐药的发生，提高抗病毒治疗疗效。