乙型肝炎病毒基因分型技术发展现状

中华肝脏病杂志网络版2003网络论文

杨光 崔金环 司建华

【摘要】目的 综述乙型肝炎病毒（HBV）基因分型技术方法的现状和存在问题，并提出建立新的技术方法的可能性。方法 查阅国内外主要的HBV基因分型标准和现行技术方法，分析各种方法的优缺点。结果 HBV的基因分型方法可分为全基因序列比对和片段基因序列比对两大类。全基因序列比对由于其技术复杂和费用昂贵难以常规使用；片段基因序列比对利用HBV中的代表性片段的序列类型来反映全基因序列的类型，现有的主要技术类型有片段序列测定、限制性片段长度多态性分析、型特异引物扩增和型特异探针检测等。结论 型特异探针检测法，由于具有易进行单管PCR扩增，操作相对简单和费用低而最具有实用价值。基因芯片技术具有高敏感、高通量和能够平行检测DNA类型等特点，利用基因芯片技术有可能为HBV基因分型建立一种前所未有的型特异性探针检测新方法。

【关键词】肝炎病毒；乙型；检测，分型；基因芯片

我国是乙型肝炎病毒（HBV）感染的高发区，慢性乙型肝炎又是我国肝硬化、肝功衰竭和原发性肝癌的主要危险因素。随着乙型肝炎病毒（HBV）全基因序列测定病毒株的增多，近些年人们开始根据生物系统发生学中的基因分类法建立HBV的基因分型技术和标准。对HBV进行基因分型有利于对HBV感染的流行病学、病因学和临床诊治进行更加深入细致的研究，现有研究表明不同亚型的HBV感染的临床病程和对治疗的反应都存在着一定的差异。

一、HBV基因分型的意义

1988年Okamoto通过对18株不同血清型的HBV DHA全序列比较后发现血清型不能真正反映HBV基因组的差异，并认为全基因序列差异≥8%可定为HBV不同的基因亚型。他们将这18株分为A、B、C、D4个基因型。随后，Norder补充并完善了HBV基因分型，将HBV分为A、B、C、D、E、F6个基因型。他们同样发现，同一血清型可分布在不同的基因型之中，尤其以adw血清型的核酸序列变异程度最大，如adw可分布在A、B、C三型之中。

HBV基因分型除有流行病学的意义外，还可能与HBV的感染途径和疾病进程相关。台湾学者研究发现在Norder分型中，肝硬化患者多为C基因型，占60%，而以无症状携带者作对照C基因型仅占23%，提示C基因型与较为严重的肝病有关；在50岁以上的肝癌患者中C型占41%，50岁以下的肝癌患者中80%为B型，35岁以下肝癌患者中B型为90%，提示B基因型可能与低年龄组肝癌的进展有关。另有研究显示，在西欧90%以上HBV为A型与乙型肝炎慢性化进程有关。HBV基因型还与某些热点变异出现的频率有关，如C基因型较多发生ntl762-1764位AGG→TGA突变，而B型则很少发生这种突变。HBV基因型与药物治疗的反应性的关系也在研究中。

二、HBV基因分型的现状

目前，国内外对HBV进行基因分型的方法可分为全基因序列比对和片段基因序列比对两大类。全基因序列比对是以生物系统发生学中的基因同源性为基础的，它主要是通过HBV全基因序列测定来进行基因分型，另外，也可应用对HBV全基因进行限制性片段长度多态性分析技术（RFLP）。片段基因序列比对是利用HBV中的代表性片段的序列类型来反映全基因序列的类型，主要技术类型有片段基因序列测定、RFLP、型特异引物（SSP）扩增法和型特异探针（SSO）检测法等。序列测定虽然结果准确可靠，但是由于其技术复杂、实验条件要求高和费用昂贵难以常规使用；RFLP技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异影响，且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响分型结果判断；应SSP法进行PCR扩增需要多个扩增管，相对费用也较高；应用SSO法可通过对单管的PCR产物进行检测来分型，因此具有操作相对简单和费用较低等特点，最具有实用价值。

基因芯片技术是近几年发展起来的新技术，它通过借鉴电子计算机机芯片阵列寻址原理，利用核酸分子杂交和化学发光技术，使检测结果具有灵敏度高、所需样本微量和操作简便等特点，是一种先进的SSO法。理论上，利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断的方法是完全可能的，但是目前尚未见有基因芯片进行HBV基因分型的研究报道。

三、HBV基因分型芯片

基因芯片（gene chip），又称基因微矩阵（microarray），其原理是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上，然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原理进行杂交，通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度。经计算机分析处理数据资料，获取样品数量和序列信息，从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究。

20世纪80年代末到90年代初，美国Affymetrix公司率先开展了这方面的研究。1991年，该公司生产了世界上第一块寡核苷酸基因芯片。同时，随着荧光标记、激光共聚焦扫描和计算机分析等技术发展，1995年在美国Stanford大学诞生了第一块以玻璃为载体的微矩阵基因芯片，标志着基因芯片技术步入了广泛研究和应用的时期。我们从1999年开始构想应用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒（HBV）基因分型诊断芯片。

HBV基因分型芯片是将型特异探针固定在载玻片下制成。在PCR扩增HBV分型区域时，应用荧光标记的dNRP使PCR产物带有荧光，通过将PCR产物与HBV基因分型芯片杂交后某型处的杂交点出现荧光而确定HBV的基因类型。因此HBV基因分型芯片属PCR扩增型特异探针（SSO）杂交分型法。同属PCR扩增型特异探针（SSO）杂交分型法的微板核酸杂交—ELISA技术，简称微板法，在HBV基因进行分型中的成功应用，为我们建立HBV基因分型芯片提供了很好的借鉴。微板法通过在微孔中的包被型通用序列探针与待测PCR产物杂交，然后再用酶标记各型探针来检测HBV的所属亚型。其操作程序如下：抽提检测样本中的HBV-DNA，应用PCR进行基因扩增，将PCR产物加入包被有型通用序列探针的6个微孔中，如有HBV-DNA扩增产物存在，HBV-DNA扩增产物将被包被的型通用序列探针捕获而滞留于微孔中，然后再将用酶标记6型探针分别加入各个微孔中，哪个亚型的微孔显色，HBV便属该亚型。

根据Norder等公布的HBV各基因型的不同序列，我们考虑选择前C区的保守段作引物进行PCR扩增，从可变段中选出6型作为基因芯片的型特异探针，来实现对HBV的基因分型。引物和探针的序列见下表。

Sequence 3’-5’

Postition

Primer 1

CCC TTC TTC GTC TGC GGT TCC

nt1490-1510

Primer 2

ACC AAT TTA TGC CTA CAG CCTC

nt1798-1777

Genotyping probe

Probe A

TTG GGC AGG ATC TGA TGG GC

nt1646-1627

Probe B

TTG GGC AAG AAT TGG TGG GC

nt1646-1627

Probe C

TTG GGC AAG ACC ATG TGG GC

nt1646-1627

Probe D

TTG GGC AGG TTC CGG TGG GC

nt1646-1627

Probe E

TTG GGC AAT ATG TGG TGG GC

nt1646-1627

Probe F

GAC TGT TGG CAA ACT CCA GG

nt1646-1627

基因芯片技术与微板法的不同之处仅仅在于，基因芯片是将基因分型用的型特异探针点样到玻片上，直接与标记有荧光的PCR扩增产物杂校，漂洗后通过荧光扫描来判断结果。操作程序如下：抽提检测样本中的HBV-DNA，应用PCR进行基因扩增，在扩增液中加入一种荧光标记的dNTP，使PCR产物带有荧光，直接将PCR产物与HBV基因分型芯片杂校，如在某一种型特异性探针之处出现荧光，即可确定HBV属于这一基因类型。

基因芯片法与微板法的比较如下表：

微板核酸杂交-ELISA法

基因芯片

支持物

微孔板

玻璃

固定探针

型通用序列

分型探针

杂交反应体系

不同

相同

显色

酶联显色

荧光

结果分析

酶标检测仪

荧光扫描仪

操作

较复杂，手工化

简例，自动化

两种检测方法最主要的区别在于：①基因芯片信号结果是用荧光扫描仪扫描获得，其灵敏度远比传统的酶标检测仪高，且杂交洗涤后直接扫描，操作简便，而微板法还需进行酶联反应操作，手工操作作为主。②基因芯片把阴、阳性对照和待检样品的DNA在同一反应体系中进行杂交，可以很好的对阴、阳性结果进行监控分析，更好地确保避免假阴性或假阳性的出现。微板法由于在不同微板孔里杂交，虽然能进行平行实验，但不易从根本上消除假阴性或假阳性。③微板法包被的是型通用序列，杂交时才加入分型探针，而基因芯片直接把分型探针固定在玻片上，可避免由于通用序列变异而出现的假阴性。

基因芯片用于乙型肝炎病毒的基因分型检测有很多潜在的优势，但在实现过程中可能会遇到许多有待解决的问题。主要是由于PCR产物与芯片上的各种探针杂交时，需要在不同一体系中进行，而各种探针的长短与G+C含量都可能不同，使最佳杂交和洗涤温度不一，这就需要对反应条件进行同化，以提高杂交的质量和效率。

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【作者单位】528000 佛山市第一人民医院临床医学研究所