乙型肝炎病毒及其常见的基因突变

　　　　　　　　　　　　　　　　　复旦大学附属华山医院 王新宇 张继明

　　大多数生物能够通过复杂的机制来维持其遗传信息的稳定性，而病毒却相反，它们处于快速和持续的基因变异之中。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)具有独特的生活周期，在复制过程中尽管产生大量的子病毒，但并不直接杀伤被其感染的肝细胞。由于HBV的复制需通过逆转录机制，故HBV变异较为常见，并且，在内源性(宿主免疫清除)和外源性(疫苗和抗病毒药物)的选择性压力作用下，更容易选择出逃避突变株。现在仍不清楚哪些特殊的突变可直接影响肝脏疾病的临床表现、HBV感染的持续性和预后。因此，今后有必要进一步研究HBV变异的机制，这有助于了解HBV与宿主之间的相互作用，并为完全控制HBV感染提供新的策略。本文对HBV基因组结构、特点、常见变异及意义作一概述。

　　一、HBV的形态学

　　HBV是一种有包膜的双链DNA病毒，属于嗜肝病毒科。该科还包括在遗传学上相似的其他嗜肝病毒，它们可分别感染灵长类动物和猴子，土拨鼠(woodchucks)和地松鼠(ground squirrel)，苍鹭(heron)和鸭子。

　　在高HBV载量患者的血清中，通过电镜观察可以发现3种与HBV相关的颗粒。完整的HBV颗粒(Dane particle)的直径为42nm，外层为HBV表面抗原(HBsAg)组成的包膜，内层是HBV核心抗原(HBcAg)构成的核衣壳，后者包裹HBV基因组和相关的聚合酶。血清中最多见的是直径17～25nm的小球形颗粒，其数量可达到1013/ml，而稍微少一些的是直径约为20～22nm、长度不一的管状或丝状颗粒，数量约为1011/ml。后两种亚病毒结构不含有HBV DNA，无感染性。

　　二、HBV基因组

　　HBV的基因组是部分双链的DNA分子，长度约为3200bp。两条线性DNA链通过5’端间的226bp粘性末端构成环状结构，粘性末端的两侧各有一个11bp组成的直接重复序列，被称为DR1和DR2。在HBV颗粒内，HBV负链的长度是固定，有明确的5’和3’端，但HBV负链并不是闭环结构，在正链的5’ 末端附近，负链上有一小缺口(nick)，并且，负链的5’端有8～9bp的冗余，使这一小段成为3链结构。HBV多聚酶(polymerase, pol)与负链的5`端通过共价键结合。正链的5`端附着一个18bp长的寡核糖核苷酸，具有信使RNA(mRNA)一样的帽状结构。正链的3`末端长度不固定，因此大多数HBV基因组都含有一段单链的、长度不一的缺口区域(gap region)，长度为基因组长度的20～80%，这段区域可借助内源性的HBV DNA多聚酶补齐而成为双链[1]。

　　HBV负链包含4个开放的读码框架(ORFs)，即Pre-S/S ORF、Pre-C/C ORF、Pol ORF和X ORF，分别编码包膜蛋白(HBsAg)、HBeAg 及核心抗原(HBcAg)、HBV多聚酶(Pol)和X多肽(HBx)。Pol ORF最长，Pre-S/S ORF完全与Pol ORF重叠，Pre-C/C ORF和X ORF也部分与Pol ORF重叠。由于HBV的一个ORF可含多个AUG(起始密码子)，因而可编码多种嵌套的有着不同N-末端的蛋白。

　　Pre-S/S ORF编码的HBsAg包括小(SHBs)，中(MHBs)，和大(LHBs)蛋白，它们都有糖基化和非糖基化两种形式。N-连接的糖基化作用和糖苷酶处理是形成病毒颗粒所必须的，但是亚病毒颗粒形成和病毒颗粒的分泌并不需要以上处理。SHBs由226个氨基酸组成，是3种HBsAg相关蛋白中含量最丰富的一种，含有较多的半光氨酸残基，它们相互交叉连接，形成构像性襻状结构，称为HBsAg的主要抗原决定簇，即“a” 决定簇，所有已知HBV分离株的HBsAg均含有此决定簇。“a” 决定簇还包括亚决定簇d / y和w / r，亚决定簇“d”或“y”分别指SHBs的122氨基酸为赖氨酸或精氨酸；亚决定簇“w”或“r”分别指SHBs的160氨基酸为赖氨酸或精氨酸。不同的亚决定簇诱导的抗HBs具有交叉保护性。

　　MHBs由前-S2和SHBs组成，前-S2是SHBs的N-末端延伸，长约55个氨基酸，其中心部分携带着主要的抗原表位，但与SHBs不同，其免疫表位为非构像依赖性，并且，MHBs也不是病毒颗粒组装和释放所必需的。MHBs第3～16位氨基酸区域能够与多聚人血清白蛋白(pHSA)结合，这种结合的意义目前还不清楚。由于MHBs在B细胞水平的免疫原性比SHBs强，有些国家已用动物细胞系生产含前-S2的HBsAg，并已作为疫苗应用于临床。

　　LHBs是由MHBs及其N-末端的一段108个或119个氨基酸长度(根据不同的亚型和基因型)的延伸组成，因此，LHBs包含前-S1，前-S2和S，呈糖基化形式。在成熟的病毒颗粒和HBsAg颗粒，前S 蛋白暴露于颗粒表面，S和前S2被前S1所遮盖。和MHBs不同，LHBs是病毒颗粒形成和感染性维持所必需的。 LHBs有着重要的B和T细胞的抗原位点，在病毒感染后的恢复和感染的保护方面起着重要的作用。在前S1编码区，主要的免疫表位位于27～35、72～78、95～107位氨基酸残基。在T细胞水平，LHBs的21～48、81～108位氨基酸残基也具有较强的免疫原性。

　　C ORF编码核心蛋白P21(HBc蛋白)，它是组成病毒核衣壳的主要多肽，表达形式为HBcAg。依据HBV基因型的不同，HBcAg由183、185或195个氨基酸组成。HBcAg含有2个完全不同的功能区，第1～144位氨基酸是32 nm核衣壳的装配区，HBcAg羧基端至150位氨基酸段是精氨酸富集区，类似于鱼精蛋白，可与核酸结合，与HBV的包装及复制有关。HBcAg羧基端的精氨酸富集区又可分为4个精氨酸丛集区，并且还包含1个细胞核定位序列。HBcAg含很多亲水区和带电荷的氨基酸，不含脂类，受细胞激酶的作用而部分磷酸化。精氨酸丛集区3与4之间的170～172位丝氨酸的磷酸化可阻断与核酸的结合，负性调节HBcAg在核内的定位。

　　HBeAg是HBc蛋白的分泌型，呈可溶性，被视为HBV的一种附属蛋白。前C序列在核心蛋白基因序列的上游，由前C 的AUG起始合成长为212个氨基酸的前C / C蛋白(P25或HBe蛋白)，它是HBeAg的前体蛋白,由核心蛋白和氨基端的29个氨基酸组成。P25起始部分的19个氨基酸起信号肽作用，为转运P25进入内质网提供信号。信号肽随后被宿主信号肽酶裂解，形成中间产物P22。P22羧基端的34个氨基酸被细胞蛋白酶切割，形成可分泌的15～18 kDa 的蛋白，即HBeAg。

　　HBeAg有至少两个B细胞的表位，即HBe1和HBe2，HBe1是线性的，HBe2为构像性的[2]。HBe1和HBe2表位的分别位于核心氨基酸残基的第85和138位，HBcAg有2个免疫优势B细胞表位，位于在氨基酸残基74～83(HBc1)和107～118(HBc2)等区段，HBc1与HBe1呈共线性(colinearity)。已知的HBc蛋白的CTL表位分别位于氨基酸残基18～27位(HLA-A2限制的)和141～151位(HLA-A31和HLA-Aw69限制的)，91～110和111～125也是潜在的HLA-A2限制的CTL表位。HBc蛋白3个T辅助细胞(TH)的表位分别位于氨基酸残基1～20、50～69和117～131等区段。尽管HBe和HBc蛋白在功能及其转运等诸多方面上不相同，但在序列上大部分是相同的，在T细胞水平具有很高的交叉反应性。

　　Pol基因是最长的ORF，横跨了整个基因组的80%，并且与其它3个ORF相重叠。Pol蛋白翻译起自HBV前基因组RNA，其产物为816个氨基酸的多功能蛋白，包含4个区域。氨基端为末端蛋白(terminal protein，TP)，它可与HBV负链的5’端共价结合，引导HBV负链的合成。紧邻TP的是间隔区，尚未发现此区有特殊的功能。多功能蛋白的羧基端为RNA酶H，它可裂解逆转录过程中形成的RNA-DNA杂交体中的RNA。介于间隔区和RNA酶H之间的为RT区，其性质为RNA和DNA依赖的DNA聚合酶，催化HBV的逆转录和DNA链的合成。Pol编码至少2个T细胞表位，分别位于氨基酸残基107～115和227～235。目前认为，HBV DNA聚合酶除了作为功能蛋白在HBV复制中起作用外，它还是重要的结构蛋白。完整的DNA 聚合酶对于HBV前基因组RNA的包装是必要的。聚合酶优先包装其自身的模板(称为顺式包装)，变异导致的DNA聚合酶功能的消失并不影响其包装作用。

　　X ORF编码一段154个氨基酸长的多肽，分子量为17 kDa，称为HBx蛋白，分子量为17kDa，是HBV的第2种附属蛋白，在所有哺乳动物的嗜肝病毒中，HBx蛋白的序列较为保守。全长HBx的表达在HBV体外增殖过程中不是必要的成分，但是在体内感染过程中却是一个关键的要素。HBx蛋白通过直接与转录因子，如RNA聚合酶II的RPB5亚单位、TATA结合蛋白、ATB等相互作用，反式激活HBV和细胞基因的启动子。此外，HBx蛋白还可激活Ras/Raf/MAP激酶级联反应的信号转导途径。

　　HBx蛋白的另一个重要功能是，它在HBV介导的致癌作用中作为一个辅助因子发挥重要作用，但具体的致癌机制仍不明确。可能与HBx的反式激活作用引起的某些基因表达有关。已发现HBx的反式激活作用可灭活肿瘤抑制基因P53,引起细胞周期调节紊乱、中止P53依赖的细胞凋亡。26S蛋白酶体复合物是HBx另一个重要的靶位，可逃避免疫清除，抑制HBV抗原的呈递。

　　三、HBV的生活周期和复制

　　所有嗜肝病毒均具有高度的种和细胞特异性，这种特异性取决于病毒颗粒与细胞表面的相互作用。感染发生的第一步是HBV与肝细胞附着并进入肝细胞质。随后HBV颗粒脱去外膜和核衣壳，HBV基因组通过细胞核小孔转运至细胞核内，形成松弛环状DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)。在细胞核内，rcDNA去掉负链5’端连接的末端蛋白、正链5’端连接的加帽的RNA;在DNA聚合酶作用下延长正链；去掉负链5’端的冗余；封闭DNA链上的缺口，最后转换为共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, ccc DNA)。以ccc DNA为模板转录基因组和亚基因组HBV mRNA，包括3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb mRNA。2.4kb mRNA主要编码HBV的外膜大蛋白；2.1kb mRNA编码HBV外膜的中、主蛋白；0.7kb mRNA编码HBx蛋白；3.5kb mRNA编码核心蛋白和多聚酶蛋白。3.5kb mRNA由于含有HBV DNA的全部遗传信息，还是逆转录的模板，因而被称为HBV前基因组RNA,并与聚合酶一起被核衣壳包裹，形成核心颗粒，移至细胞浆内。在核心颗粒内，HBV前基因组RNA逆转录为HBV的负链，再以负链为模板合成正链，双链环化。经外膜蛋白包装后，分泌至细胞外，产生子代病毒。

　　HBV前S1蛋白对于HBV进入肝细胞的过程起重要作用，因为已有研究发现，HBV前S1蛋白能与肝细胞膜结合，而抗前S1抗体可阻断HBV与肝细胞膜的结合。许多细胞蛋白和可溶性蛋白被推测为HBV的宿主受体，但没有一种被肯定。其他环节，如HBV的穿入、脱衣壳等的机制也不清楚。

　　维持以上HBV复制周期的关键是病毒ccc DNA合成的调节。在持续感染时，并非所有的病毒核心颗粒都被包装和释放。有一些核心颗粒还可通过细胞内转换途径(intracellular conversion pathway, ICP)进入细胞核，补充ccc DNA分子的拷贝数。这样，新复制的基因组DNA就扩增了ccc DNA池，也就在细胞内建立了一个的转录模板(ccc DNA)池，从而不再需要多轮的再感染。因此，核心颗粒在把成熟的病毒基因组转送到感染的细胞核的过程中扮演了一个非常重要的角色，使持续感染肝细胞的核内的HBV DNA得到不断的补充和扩增，维持了病毒持续感染所需要的病毒微染色体池(viral minichromosome)。这条途径的调节十分复杂，目前了解甚少。但是可以肯定地是，持续和稳定的ccc DNA是长期维持HBV慢性感染的关键因素。

　　四、控制HBV复制的调节元件

　　在HBV基因组中分散存在多个控制HBV复制和基因表达的调节元件。由于HBV每一区域都是蛋白编码序列，故所有顺式作用的调节元件都包含在编码基因的序列之中。HBV的这种遗传学排列在病毒中是很少见的，因为绝大多数病毒的顺式调节元件通常位于病毒的非编码区。作为调节元件的一段DNA序列，可与某些细胞蛋白或病毒蛋白结合，正性或负性调节转录。HBV的调节元件包括4种启动子(promoter)，2种增强子(enhancer)、糖皮质激素反应元件(glucocorticoid responsive element, GRE)、负性调节元件(negative regulatory element, NRE)、CCAAT 元件(CCAAT element)、聚腺苷酸化信号(polyadenylation signal)、转录后调节元件(post-transcriptional regulatory element，PRE)、包装信号ε(encapsidation signal ε)等， 后3个调节元件作用于HBV 的RNA。

　　五、HBV变异和准种产生与选择

　　由于HBV Pol是一种逆转录酶，缺乏校正的功能，因此，HBV变异率比其它DNA病毒大约要高10倍左右，发生变异的频率大约为(1.4～3.2)×10-5核苷酸替换/位点/年。HBV发生变异的概率也受到患者所处的临床分期及所接受的临床治疗的影响，例如，是处于免疫耐受还是处于免疫清除清除期；是否接受免疫抑制治疗和器官移植等。

　　在一个HBV感染者的血清中，在HBV准种池内占多数的病毒群通常成为优势株。宿主免疫系统的选择性压力、重叠的读码框架所引起的限制性、存活能力、病毒的复制潜能等维持了HBV优势株的稳定性。此外，病毒复制的数量和速率对优势株的稳定性也是十分重要的影响因素。多数研究结果表明，血清中总的病毒载量可高达1011病毒颗粒/ml，血HBV池的半衰期大约为1～2天， 每日新产生病毒颗粒的数量可能高达1011病毒颗粒。如此高的病毒载量和更新率以及较低的复制忠实性(replication fidelity)等均可影响变异的产生和HBV准种池的容量。

　　变异病毒的复制必须有可用的复制空间(replicaton space)。变异株是通过占据原来野毒株的位置而获得复制空间的，此过程的前提是原来野毒株的消失，而原来野毒株能否消失则受其本身的复制适应性、肝细胞的更新、增殖等影响。复制空间可以理解为肝脏容纳新的HBV ccc DNA分子的潜力。新生的ccc DNA分子只能在未感染的细胞、更新的肝细胞、核内ccc DNA已消失的感染肝细胞中合成。所以，一株病毒成为优势株首先要增加其cccDNA合成，然后才能实现病毒量的扩增。换句话说，只有在拥有新的复制空间的前提下，HBV耐药株在肝内的数量才会增加[3-5]。

　　 六、病毒基因型

　　目前发现的HBV基因型有8种，分别被命名为A到H型，各型HBV全基因核苷酸的差异为8%[6-7]。这些基因型拥有各自独特的序列插入和缺失。例如，A 基因型HBV和其它基因型的不同之处在于其多聚酶基因的末端蛋白区域有一段6个核苷酸(nt)的插入序列。而D基因型HBV在多聚酶基因的间隔区有一段33-nt的缺失。而E和G基因型HBV在相同的区域都有3-nt的缺失(表 1)。G基因型HBV还在核心基因的N末端有一段36-nt的插入序列。HBV基因型的命名是基于整个基因组序列，因此，它比以前使用的血清学亚型的命名法更加可靠。血清学分类是基于包膜蛋白中少数氨基酸的差异而进行的，特异性抗体可与不同血清亚型的包膜蛋白起反应。4种主要的HBV亚型(adw、 adr、ayw和ayr)和基因型的关系已经被确定。(表 1)

　　HBV基因型之间存在着致病和治疗应答方面的不同。例如，C基因型HBV与B基因型相比，C基因型HBV感染者的病情往往较重，而D基因型HBV感染者也比A基因型的病情重。C和D基因型HBV感染者比B和A基因型对干扰素治疗的应答率低。已发现B和C基因型、A和D基因型等2种基因型的重组，产生更加多样的基因型[8-10]。还有证据表明，与HBV类似的嗜肝病毒在灵长类动物中分布广泛，提示这些HBV可能有一个共同的的起源，在类人的动物之间可能存在嗜肝病毒的跨种系传播。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　表 1 HBV的主要基因型简介 　　　　　　　　

基因型 亚型 　基因组 　长度(nt) 　　　HBV蛋白 变异频率 全球分布 Pres1 Pol Core PC BCP A adw2, ayw1 3221 119 845 185 不常见C1858) 常见 西欧、美国、非洲中部、印度 B adw2, ayw1 3215 119 843 183 常见(T1858) 常见

日本、台湾、印度尼西亚 中国

　　　　　　注：1、Pre-S2长为55个氨基酸；S为226个氨基酸；
　　　　　　　　2、“PC”指前C区变异(Precore mutation)，如G1896A变异；
　　　　　　　　3、“BCP”指基本核心启动子变异(basic core promoter mutation)，如A1762T, G1764A；
　　　　　　　　4、“常见”指变异株占50%以上；“不常见”指变异株少于10%；“很常见”指变异株占绝大多数；
　　　　　　　　5、“ND”指未见报道。

　　七、HBV常见的变异

　　病毒和宿主因素以及外源性的选择性压力决定了HBV的优势株的构成。外源性的压力包括应用核苷/核苷酸类似物、α-干扰素、乙型肝炎免疫球蛋白(HBIg)和疫苗等。尽管对引起HBeAg减少或消失以及最终的HBsAg消失的免疫性选择压力的作用机制所知甚少，但这种选择压力在HBV变异株选择中所起的作用是极为重要的。

　　1、BCP，前C区和核心区基因的变异

　　实验证实，有两组变异可造成HBeAg表达的减少或终止。第一组变异的位点位于前C区基因的nt1896位，G1896A单个碱基的替换造成了翻译终止密码的产生(密码子28由TGG变为TAG；TAG为终止密码子)，而密码子28是前C区基因内的ε结构中的倒数第二个密码子。ε结构是一个高度保守的茎襻结构，其中的nt G1896和茎襻结构中的nt1858位形成碱基配对。在B，D，E，G和某些C基因型的HBV前C区茎襻结构中，第1858位碱基是一个T(胸腺嘧啶)(表1),发生G1896A变异后，第1858和1896碱基形成T-A配对，有利于稳定ε结构，因此，这些基因型HBV容易发生前C区G1896A变异。与之相反，A，F和某些C基因型HBV很少发生前C区终止变异，其原因是这些基因型HBV的第1858位的碱基是C(胞嘧啶)，与1896位碱基G一起，形成了稳定的G-C碱基配对。发生G1896A变异时，变异株前C区所编码的产物在解脱信号肽后，只遗留10个残基地短肽，不能再产生HBeAg，但HBV可继续复制，形成持续的病毒血症。由于HBcAg与HBeAg有交叉免疫原性，虽HBeAg呈阴性，却仍可引起宿主持续的抗HBe应答。

　　其它的3变异(位于1817，1874和1879位碱基)可造成HBeAg的截断。涉及起始密码子的变异(第1814，1815，1816位碱基)也有报道。在前C区G1896A终止变异株，G1899A变异也很常见。

　　早期的研究提示，HBV前C区终止变异可能与重型乙型肝炎和暴发性乙型肝炎(FHB)的发生有关。然而，这一变异也可见于无症状的HBV携带者。直至目前，HBV前C区终止变异与暴发性肝炎以及乙型肝炎严重度之间的关系依然不能被确认。

　　第二组变异发生在BCP区，如A1762T与G1764A联合变异。根据HBV基因型的不同，A1762T与G1764A联合变异可单独或与前C区变异一起出现(见表1)。A1762T与G1764A的双变异可导致HBeAg的产量减少70%。BCP的变异可减少其与肝脏特异的转录因子的结合，从而导致前C和C mRNA的转录减少，最终造成前C区蛋白的减少。但是，这一变异并不影响HBV前基因RNA的转录和核心蛋白或多聚酶蛋白的翻译。由于去除了HBV前C区蛋白对HBV复制的抑制作用，与HBV前基因RNA相近的前C/C mRNA的转录减少，因此，BCP变异株的复制能力可能有所增强。和前C区变异株一样，BCP变异株也没有被确认为潜在的毒力标志。

　　与HBeAg阳性慢性乙型肝炎相比，HBV前C区变异或BCP变异株所致的HBeAg阴性慢性乙型肝炎对抗病毒治疗的应答有所差异[11]。HBeAg阴性慢性乙型肝炎对α干扰素的疗效低于HBeAg阳性慢性乙型肝炎，α干扰素治疗后12个月的持久应答率平均为24%，停药后5年内的复发率达50%以上。而HBeAg阳性慢性乙型肝炎HBV DNA的转阴率为37%，HBeAg转阴率为33%。对HBeAg转阴者随访4～8年，80%～90%患者的HBeAg可维持阴性。对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，推荐的疗程为16～24周。对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者，推荐的疗程至少为12个月。

　　拉米夫定对HBeAg阴性慢性乙型肝炎的疗效也不理想， 拉米夫定治疗1年后，HBV DNA转阴率分别为65%(bDNA法)和39%(PCR法)，但90%的患者在停药后出现复发。

　　C基因区相当保守，但在慢性HBV感染中，C基因的变异可能并不少见。C基因的变异绝大部分集中在aa48～60、aa84～101、aa147～155 3个区段中，较常见的变异包括L60V、S87G、I97L等变异。其中，I97L变异相对多见，且与病变的进展有关。此外，C基因中段还可以发生缺失变异，仍能产生HBcAg,但可降低HBV的复制。

　　核心基因含有B细胞和杀伤性T细胞(CTL)的表位。在慢性乙型肝炎的病毒清除期，这些表位变异的HBV容易被选择出来，成为逃避变异株[12]。Akarca和Lok已经证实，核心基因突变的频率与前C区终止变异、HBeAg阴性和活动性肝病相关。由于HBV感染时的肝细胞损伤是免疫介导的，而HBcAg是免疫攻击的靶抗原，因而推测C基因变异可能与病变活动和感染清除相关。有学者分析了慢乙肝患者血清中HBV C基因第130位氨基酸(T、B细胞共同的表位)变异与肝损害关系，结果发现慢乙肝患者病情加重、ALT 升高时变异株占优势，而在ALT高峰下降后野毒株占优势，而慢性携带者野毒株始终占优势。C基因变异与细胞免疫之间关系仍需作更深入的研究。

　　2、X基因的变异

　　X基因是病毒复制的重要调节区，是转录、反转录和正链合成的起点，也是多种细胞因子结合点，此区发生变异将影响到病毒的转录和复制。X基因内的C基因调节序列区包括多个调节元件，包括DR1/DR2、负链缺口、增强子II和目前研究较多的核心启动子(CP)。CP由核心上游调节序列(CURS)和基本核心启动子(BCP)两部分构成，CP上游为负性调节元件(NRE)。X基因变异可能影响到控制HBV复制的调节元件，如BCP和EnH2。因为BCP包含nt1742～1802的区域，与X基因的读码框架重叠，因此，BCP的A1762T与G1764A联合变异也同样会引起X蛋白xK130M和xV131I变异。

　　此外，一种新的HBx变异株已经在肝细胞肝癌(HCC)患者血清中发现，这种变异株可增加克隆的增殖，减少细胞的凋亡，提示可能与肝癌的发生有关。

　　3、包膜基因的变异

　　前S序列是整个基因组中异质性最高的区域。通过对慢性HBV携带者血清中的HBV DNA序列进行分析，已经发现前S区基因存在点突变、缺失和基因重组等。不能合成前S2蛋白的HBV毒株也较常见，并且常为优势株。前S2区与Pol蛋白的间隔区重叠，而后者并不是Pol活性所必需的，因此，前S2区变异并不影响Pol的活性。

　　大多数的乙型肝炎疫苗包含226个氨基酸残基组成的HBsAg。针对HBsAg 主要亲水区(major hydrophilic region, MHR)的免疫反应可诱导免疫保护作用。在MHR内有一个免疫优势表位,称为“a”决定簇，位于HBsAg氨基酸序列中的124～147位，是HBV各亚型的共同决定簇，有一定的空间构型，由被动免疫产生的抗体90%是针对“a”决定簇，此种抗体可对所有亚型的HBV感染提供保护性免疫。“a”决定簇内的几个、甚至单个氨基酸的改变，将破坏构型的稳定性，从而改变其抗原性和免疫原性。

　　在疫苗诱导的抗体所产生的压力下，可出现MHR内的变异。目前已证实，这种S基因变异株可引起免疫逃避。最先发现和最常见的变异株为HBsAg 的G145R毒株，于11年前首先在意大利被发现，随后在中国大陆、台湾、日本、泰国、巴西、新加坡、美国等也被陆续发现。台湾的研究发现，在HBV DNA阳性的儿童中，HBsAg的 “a”决定簇变异率在1994年已达28.1%。S基因G145R变异株较原型毒株有生存优势，体外实验证明，G145R突变株的免疫原性、与原型毒株抗HBs的结合力均发生明显变化。“a”决定簇内的其他氨基酸变异，如126位、129位变异也可引起类似的免疫逃避现象。由于HBV免疫逃避变异株的出现，部分儿童即使接种了乙肝疫苗，仍可能发生HBV突破性感染(Breakthrough infection)，提示未来的乙肝疫苗应包括野毒株和变异株的S蛋白。但目前认为，HBV逃避变异株尚不足以对已在进行的乙肝疫苗接种计划构成威胁[13]。

　　这种变异株的产生机制目前仍不明确，有人认为这种变异株是母亲体内的少数毒株经垂直传播给婴儿后，经免疫选择成为婴儿体内优势株；也有人认为母亲体内无这种变异株，是原型毒株在婴儿体内免疫压力下发生变异的结果。随着疫苗的广泛推广，促使HBV发生变异的免疫压力逐渐增大，变异发生机会增加。幸运的是，G145R突变株表达的HBsAg仍能为多数常规诊断试剂所检出。

　　由于抗HBs可对易感者提供保护性免疫，国际上普遍采用HBIG预防移植后肝脏再感染HBV。但近年来发现不少患者经HBIG治疗后仍然感染HBV，经研究发现此与HBV S基因变异有关，包括S基因第20、44、114、130、145、184和188位氨基酸等多处变异。因此，S基因变异除了影响主动免疫的效果，也会影响HBIG的被动免疫疗效。此外，研究还发现，HBIG治疗持续时间的长短与S基因变异发生率之间有一定关系，HBIG造成的免疫压力可促进S基因变异的发生。在这种免疫压力消失后，这种变异株会逐渐消失，原型毒株可再次成为优势毒株。

　　S基因变异还与HBsAg阴性慢性乙型肝炎(隐匿性乙型肝炎)的发生有关。在广东地区，对抗HBc阳性的人群进行PCR检测，发现3%人群属于HBsAg阴性HBV感染者。但在我国没有对这种变异的发生率及其对肝脏病情的影响进行大规模的研究。HBsAg阴性HBV感染是临床及流行病学面临的一大难题，是导致临床漏诊及献血员筛检错误的原因之一。

　　值得指出的是，隐匿性乙型肝炎仅部分是S基因变异引起的，而有些病人在HBsAg “a” 决定簇内未发现变异，HBsAg阴性的原因还与诊断试剂的敏感性、HBsAg水平等有关。

　　4、HBV pol的变异

　　过去，HBV Pol氨基酸序列的位置命名是从P基因的起始密码子开始的。由于不同基因型P基因编码的Pol氨基酸长度不一致，导致HBV Pol氨基酸位置的命名一直较为混乱。如A基因型HBV的P基因编码845个氨基酸，而B和C基因型的P基因编码843个氨基酸，D基因型的P基因编码842个氨基酸。这样就导致了同一个氨基酸在不同的基因型中的命名位置不一致，不利于相互交流。如YMDD基序中的M，在A基因型中位于552位，而在B和C基因型中为550位，在D基因型为539位，在E和G基因型为549位。为了消除这种基因型之间的差异，有学者重新对Pol进行了命名，命名原则如下：不同的HBV毒株P基因TP(末端蛋白)和间隔区在不同基因型中长度不一致，而所有HBV毒株的RT区长度均为344个氨基酸，并起始于一个保守序列EDWGPCDEHG[14]。基于这样一个特点，对Pol RT区进行单独命名已成为可能(见表2)。

表2 New Numbering System for HBV Pol RT Domain

　　　　　　　　　注：LMV=Lamivudine； FCV=Famiciclovir

　　目前认为，HBV对核苷类似物耐药性的产生与HBV P基因变异有关，并且HBV P基因变异是多位点的，以C区YMDD基序的变异最为重要。拉米夫定(Lamivudine)是目前公认的治疗乙型肝炎的三种药物之一，在短期内可使HBV DNA水平下降，肝功能恢复正常，肝纤维化程度得到改善。但拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的主要缺陷之一是易产生耐药性。随着治疗时间的延长，耐药率明显增加。亚洲的临床研究数据显示，拉米夫定治疗1～4年的基因耐药率分别为14%、38%、49%、66%。出现耐药后多数患者出现ALT的反跳，偶尔可发生肝功能失代偿。耐药性的产生是HBV RT区YMDD基序变异所致。使用新的命名法，拉米夫定相关的HBV耐药株的变异位置和类型为rtM204I/V(C区)± rtL180M(B区)[14], 将含有上述变异的全长HBV DNA转染细胞，发现这类耐药毒株的复制能力下降。最近，还发现一种新的变异类型，即YSDD变异或rtM204S变异(以往报告的基本是YVDD或YIDD变异)，这种变异株是从1例接受拉米夫定治疗18个月的患者的血清中发现的。体外转染研究也证实了这种YSDD变异株对拉米夫定耐药[15]。

　　HBV YMDD变异株的复制能力并不都是减弱的。Bock等最近发现，YMDD变异伴“a”决定簇内变异时，病人可出现病情恶化，体外研究结果显示，这种联合变异可使病毒的复制能力明显增强，与以往的研究结果不一致。Ono等的研究结果也提示YMDD基序之外变异可补偿HBV YMDD变异株的复制缺陷，使HBV的复制增强[16]。

　　由于HBV Pol基因的读码框架和S基因完全重叠，HBV聚合酶RT区变异可同时引起S基因变异。最近，国外已有研究发现[17-18]，拉米夫定相关HBV变异株HBsAg与抗HBs的结合力明显降低，尤其是伴“a”决定簇内变异时，HBsAg与抗HBs的结合力的降低更明显。当HBsAg与抗HBs的结合力明显降低时，可成为免疫逃避变异株，导致乙肝疫苗接种失败。由于我国每年有大量乙肝患者服用拉米夫定，是否会产生HBsAg “a”决定簇内变异，以及这种变异株是否会发生免疫逃避，是一个急需阐明的问题。
泛昔洛韦(Famciclovir)是另一类的核苷类似物类抗HBV药物，它通过活性代谢产物－喷昔洛韦三磷酸盐抑制HBV DNA聚合酶。与lamivudine不同，泛昔洛韦耐药株的P基因变异多位于B区，变异类型为rtL180M。体外试验证实，rtL180M变异株可导致HBV复制功能的下降，对Famciclovir产生抗药性。

　　最近，Angus等[19]已从1例接受Adefovir治疗96周、具有临床和病毒学耐药证据的患者血清中分离到1株HBV耐药株，序列分析发现HBV RT的D区出现rtN236T变异。经体外转染试验证实，含rtN236T变异的HBV毒株对Adefovir的敏感性显著下降。
其他核苷类似物，如Entecavir等在治疗慢性乙型肝炎过程中，尚未发现肯定的耐药变异株。

　　有关P基因自然变异(与药物选择性压力无关)及其意义的研究报告较少。最近，Lin等[20]报道，在从两例慢性乙肝患者血清中分离得到两株复制能力差异显著的全基因组HBV DNA基础上，采用构建高低复制株聚合酶功能区嵌合体及PCR定位点突变的研究策略，分析聚合酶的基因结构与复制性增强的机制，发现位于逆转录酶功能区(RT区)的HBV DNA聚合酶第652位氨基酸Ser-->Pro突变是导致HBV复制增强的决定性因素。蛋白三维结构模拟分析证实652位氨基酸Pro-->Ser突变可使聚合酶的活性受损，表明HBV DNA聚合酶652位氨基酸是影响HBV复制的新的功能位点，其临床意义有待进一步了解。作为HBV复制的主要功能区，P基因变异及其意义的研究在今后应引起足够的重视。

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