血浆置换治疗对外周血乙型肝炎病毒的清除作用

中华肝脏病杂志网络版2003网络论文·论著·CJH-NET03017

张启华  许正锯  吴晓虹  李树青

【摘要】目的：了解血浆置换(plasma exchange, PE)术对慢性乙型肝炎重度患者血清中乙型肝炎病毒（HBV）的清除作用。方法：选69例慢性乙型肝炎重度患者为PE术治疗对象，PE术前、后分别留取血清，采用聚合酶链反应结合Taqman荧光探针技术对血清中HBV进行定量测定。结果：PE术前、后病毒平均浓度分别为4.28×105±2.37×102copy/ml和3.15×104±1.08×102copy/ml, PE术前、后HBV含量下降明显(P<0.001)。结论：PE术对外周血HBV有较强的清除作用。

【关键词】血浆置换；乙型肝炎病毒；荧光定量聚合酶链反应

Effect of Plasma Exchange on Clearing Hepatitis B Virus.  ZHANG Qi-Hua, XU Zheng-Ju, WU Xiao-Hong, LI Shu-Qing. Clinical diseases research center of nanjing military district, The 180st hospital of PLA, Quanzhou 362000, China

【Abstract】  Objective To study the effect of plasma exchange (PE) on clearing hepatitis B virus in serum. Methods 69 patients suffered from severe chronic hepatitis B were selected for PE, serum samples were collected before and after PE, then polymeric chain reaction (PCR) together with fluorescent probe technique was adopted to make quantitative determination of hepatitis B virus in serum samples. Results The mean density of virus before and after PE is (4.28×105±2.37×102)copy/ml and (3.15×104±1.08×102)copy/ml, respectively. Therefore, the content of virus after PE has decreased significantly (P<0.001). Conclusion PE has fairly good effect on clearing hepatitis B virus of peripheral blood.

【Key words】  plasma exchange (PE); hepatitis B virus; polymeric chain reaction with quantitative fluorescent

血浆置换术以往主要用于高黄疸、高血脂、农药或药物中毒等方面的治疗。我科应用该技术对慢性乙型肝炎重度患者的治疗过程中发现，该技术除了有较强的清除胆红素作用外，还有很强的清除HBV作用，现总结如下。

材料与方法

一、材料

2000年5月-2002年8月对接受PE术治疗的慢性乙型肝炎重度患者69例，均符合2000年9月西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》诊断标准，男60例，女9例；年龄19-64岁，平均年龄43.2岁；每次PE术前、后分别采血，分离血清，置-86℃冰箱中备用。阳性对照组为同期慢性乙肝重度患者18例，每人前后抽血两次，间隔一天，分离冷藏备用。两组患者血清HBsAg、HBeAg、抗-HBc三项均为阳性。阴性对照组12人，为乙肝标志物全阴性的献血员，抽血分离血清后冷藏备用。

二、检测项目

1.HBV标志物的检测：血清HBsAg、HBeAg、抗-HBc等采用放射免疫法检测，试剂由山东潍坊3V生物技术有限公司提供。

2.血清HBV DNA检测：采用常规方法提取模板，按50℃反应1分钟，94℃保温2分钟，93℃3秒，60℃30秒循环40次。扩增结束后，计算机根据每个循环末采集到的荧光值，以Version 5.32软件处理数据，画出标准曲线，得出病毒浓度。试剂：Taq酶、dUTP和UNG酶，购自上海华美生物工程公司。标准品（浓度分别为4.20×103～4.20×107 copy/ml，共5管），阴、阳性对照物，PCR缓冲液等购自上海复星实业股份有限公司。引物序列为：P1: 5’ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT 3’(23BP); P2: 5’ ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA-3’(23bp)；荧光探针序列为：5’-TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTG-3’(25bp)；由上海申友公司合成。基因定量检测仪为瑞士产的Roche Light Cycler荧光定量基因扩增仪，配备Version 5.32软件，可自行处理相关数据。

三、PE治疗方法

经桡动脉和肘正中静脉建立体外循环，每次PE新鲜冰冻血浆交换量为3000ml，历时约2至4小时。血液净化系统Plasauto iQ和分离器Plasma-Flow-OP由日本旭化成株式会社生产，分离器Plasma-Flow-OP膜面积为：OP-08W。

四、统计学方法采用配对资料 t 检验。

结    果

慢性乙型肝炎重度患者69人，共做PE术88次，取得血清标本176份（88对），有效扩增80对，有8对PCR结果阴性，阴性结果未在统计之列。其中160份（80对）PE术前、后病毒量和对照组病毒量见附表。结果显示，PE术前、后病毒含量平均降低了约10倍，阳性对照组前、后两次结果无明显变化，阴性对照结果均为阴性。说明血浆置换术前、后病毒量降低明显，血浆置换术对外周血中乙型肝炎病毒有较强的清除作用。

附表  PE术前、后HBV DNA含量变化

组别

HBV DNA

例数

术前

术后

平均值

PE组

160

4.28×105

3.15×104*

9.28×104

阳性对照组

36

6.26×106

5.93×106**

6.08×106

阴性对照组

12

0

0

0

与术前比较，*P<0.001, **P>0.05

讨    论

荧光定量方法对病毒含量的测定具有很高的准确性。LightCycler扩增仪在核酸扩增过程中实现实时定量，每一循环末检测一次PCR产物量，40个循环结束时可得到一组反映核酸扩增过程中量生成的S形动力学曲线，再以标准品模板的起始拷贝数的自然对数为横坐标，以循环阈值为纵坐标，可以得到一直线型标准曲线，由此求得病毒含量。每次曲线相关系数r 值均大于0.998，证实定量结果的准确性。PCR扩增体系中加入dUTP和UNG酶，能够有效清除污染的扩增产物对检测结果的干扰[1]。扩增与检测整个过程均在封闭的毛细管中进行，防止扩增过程的污染。引物的特异性扩增和荧光探针与产物的杂交，双重严格保证产物的特异性。用乙肝患者作对照，排除了病人本身病毒量改变的可能。PE术除了能迅速祛除高胆红素、毒性物质和炎症介质，增加血浆蛋白外[2]，本资料统计结果说明，PE术还有很强的清除HBV的作用。而清除HBV能力的大小与滤过膜孔径和血浆交换量有关。同一病人隔一星期做一次PE，每次PE术后病毒含量比前一次均有不同程度的降低。而每做一次PE病毒量下降约10倍，很有规律。但病毒浓度为103copy/ml以下时再做PE改变却不明显。说明PE术对减轻病毒血症和缓减肝功能衰竭有一定的作用，可提高对重肝病人抢救的成功率。同时还发现同一患者本次PE术后与下一次PE术前的病毒量几乎一样，一星期内病毒量改变不大。说明乙肝病毒在慢性乙型肝炎重度患者体内的复制是缓慢的。

参 考 文 献

[1]张正，赵晓涛. 聚合酶链反应及其相关技术在临床微生物检测的应用前景. 中华检验医学杂志, 2000, 23: 69-70.

[2]江元森，陈幼明，姚集鲁等. 人工肝支持系统治疗重型肝炎的疗效评价. 中华内科杂志, 2000, 39:115-117.

作者单位：362000福建省泉州市，解放军第180医院南京军区临床肝病研究中心