肝纤维化的发生机制

　　肝纤维化(Hepatic fibrosis)是各种原因(如病毒、乙醇、寄生虫、铜铁沉积等）引起的慢性肝损伤所共有的病理改变，其特征是以胶原为主的细胞外基质(ECM)各成份因合成增多、降解相对不足而在肝内过量沉积。肝纤维化为一动态过程，属可逆性病变。但若进一步发展致肝小叶结构改建、假小叶和结节形成（肝硬化阶段）则不可逆。因此，阻断抑制或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的一个十分重要的目标。

　　近十年来，随细胞和分子生物学技术的进步，对肝纤维化发生、发展的分子和细胞机制已有了较深入了解。其进展主要体现在以下方面：(1)正常和纤维化肝脏ECM成份的特征；(2)ECM的细胞来源，确立肝星状细胞(Hepatic stellate cell, HSC)为肝纤维化ECM产生的主要细胞；(3)参与肝纤维化的关键细胞因子及其信号转导途径；(4)降解ECM的基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制物金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)的改变；(5)HSC凋亡及其在清除激活的HSC中的作用。

　　一、纤维化肝脏的ECM成份

　　ECM主要包括胶原、非胶原糖蛋白以及蛋白聚糖。肝内胶原已确定的有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、ⅩⅣ、ⅩⅧ型7种；糖蛋白有纤连蛋白、层粘连蛋白、腱生蛋白(tenascin)、巢蛋白(nidogen/entactin)、分区蛋白(merosin)、血小板反应蛋白(thrombospondin, TSP)、玻连蛋白(vitronectin)以及新近发现的一种酸性的富含半胱氨酸的分泌性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine, SPARC)等；蛋白聚糖是一类含有核心蛋白和大量多糖分子的大分子物质，多糖分子主要是糖胺聚糖包括透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素。若按核心蛋白为基础分类，蛋白聚糖可分为双糖链蛋白聚糖(biglycan)、基底膜蛋白聚糖(perlecan)、β聚糖(Betaglycan)及核心蛋白聚糖(decorin)等。

　　正常肝脏ECM不足肝湿重的0.6%。其中间质性ECM，由成纤维性胶原（I、III型胶原）和细胞型纤连蛋白、XIV型胶原即波状蛋白(undulin)以及其它蛋白聚糖组成，大多分布于肝包膜、大血管周围和汇管区。而基底膜性ECM，由非成纤维性胶原（IV、VI、XIV型胶原）及糖蛋白（主要为层粘连蛋白）、蛋白聚糖如perlecan组成，分布于肝窦Disse间隙，构成Disse间隙内皮下的呈网状结构的基底膜样基质，它可允许大分子物质自由通过，对于维持肝固有细胞包括肝细胞、HSC和窦内皮细胞的分化功能有十分重要的作用[1]。

　　肝纤维化时，ECM的量和质均发生显著变化。以胶原为主的ECM成份可较正常肝增加3－8倍；ECM的各型胶原之间、糖蛋白之间及蛋白聚糖之间的比值异常，就胶原而言，III型胶原在纤维化早期即明显增多，但随纤维化进展，可逐渐被I型胶原替代，至肝硬化时I型胶原可占胶原量的60－70％（正常肝两者各占40－45％）[2]。此时，Disse间隙内皮下的ECM也由基底膜样基质向间质性ECM转变，形成真正的基底膜，即“肝窦毛细血管化“，这可引起肝细胞表面的微绒毛减少和内皮细胞膜孔消失，而影响肝窦血流和窦内外物质交换，加重肝细胞功能障碍和门静脉高压。

　　二、肝纤维化ECＭ的细胞来源

　　肝实质主要由实质细胞及窦细胞组成。前者即为肝细胞，约占肝总体积的78－83％；后者包括窦内皮细胞、Kupffer细胞、HSC和pit细胞。尽管肝细胞、窦内皮细胞及其它诸如胆管上皮细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞等均可通过产生ECM而直接参与纤维化的形成，但目前已明确HSC是肝损伤时ECM产生的主要细胞[1]。

　　HSC位于肝窦Disse间隙，其数目与肝细胞的比例约为3.6-6:100（HSC指数）或约占肝总体积的1.4%。在正常情况下，HSC处于静息状态(Quiescent state)，胞浆富含脂滴，是体内贮存vit A的主要场所，可产生有限的ECM（主要为IV型胶原和层粘连蛋白），并可表达α-肌动蛋白和非骨架肌球蛋白，通过其胞浆突起的舒缩（内皮素－1→收缩，一氧化氮→舒张），调节肝窦血流。肝在受损后，HSC被激活转化为肌成纤维样细胞(myofibroblast-like cells, MFBLC)，其胞浆脂滴丢失、形态改变、表达平滑肌α-肌动蛋白和多种细胞因子及其受体，并大量增殖，大量合成以I、III型胶原为主的多种ECM（表1）。而且，它还参与调节ECM的降解，通过合成和分泌TIMP抑制MMP活性而抑制ECM的降解[3]。因此HSC的激活最终可造成ECM在肝内过量积聚，是肝纤维化发生的中心环节。 　

　　应当指出的是，肝细胞能合成Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、ⅩⅧ型胶原、纤连蛋白、透明质酸、硫酸软骨素及Perlecan等ECM，虽然单个细胞所产生的ECM有限，但因数量大，其作用不可忽视。

　　三、HSC激活的分子机制

　　鉴于HSC所处的核心地位，其激活的分子机制已成为研究肝纤维化发生机制的中心主题。研究表明，HSC激活可能为细胞与细胞、ECM与细胞相互作用的结果。有多种细胞因子通过旁分泌(paracrine)途径介导细胞与细胞间的相互作用，或通过自分泌(autocrine)途径作用于自身。此外，某些非肽类物质如乙醇、活性氧亦参与激活过程。

　　（一）参与HSC激活的细胞

　　1.肝细胞：肝细胞受损伤是肝纤维化的重要启动因素，它至少可通过以下途径激活邻近的HSC；（1）产生脂质过氧化产物激活HSC；(2)释放出某些促有丝分裂因子如转化生长因子－α(TGF-α)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、成纤维细胞因子(FGF)、凝血酶等促HSC增殖；(3)损伤的肝细胞膜表面精氨酸酶减少，可通过减少对周围微环境中精氨酸的分解激活HSC（HSC对精氨酸浓度的变化敏感）[4]。

　　2.窦内皮细胞：(1)肝损早期，窦内皮细胞即产生细胞型纤连蛋白，后者能直接激活HSC；(2)可产生血小板源生长因子(PDGF)、FGF、TGF-α及内毒素-1(ET-1)等促进HSC增殖，ET-1还可使HSC收缩；(3)通过激活纤溶酶参与TGF-β1由无活性形式转换为活性形式；(4)产生单核细胞趋化肽-1(MCP-1)和血小板活化因子（PAF）使炎症细胞集聚。此外，窦内皮细胞尚可产生纤溶酶原激活抑制因子(PAI)使ECM降解减少。

　　3.Kupffer细胞：肝损伤后Kupffer细胞被激活，可释放大量细胞因子包括TGF-α、TGF-β1、PDGF、TNF-α以及IL-1、IL-6等，刺激HSC转化、增殖和合成ECM。其产生的活性氧及产生的明胶酶B（MMP－9）降解Ⅳ型胶原后的产物，均可激活HSC。该细胞也是启动HSC激活或肝纤维化发生的重要因素。

　　4.炎症细胞：肝脏因炎症、坏死而浸润的单核细胞可产生TGF-α、TGF-β和PDGF等细胞因子，促进HSC增殖和ECM合成；中性粒细胞可产生活性氧激活HSC，并使血小板聚集和裂解；血小板裂解可释出PDGF、TGF-β1和表皮生长因子（EGF）等多种重要介质，刺激HSC增殖和ECM合成。

　　5.HSC／MFBLC：静息状态的HSC可表达少量肝细胞生长因子（HGF）、EGF和集落刺激因子-1(CSF-1)，但激活早期的HSC或MFBLC则产生多种细胞因子如TGF-β1、TGF-α、PDGF、FGF、ET-1和IGF-1、PAF等，不仅促进自身增殖和ECM合成，而且可刺激其周围HSC激。此外，激活的HSC还产生MCP－1、细胞因子诱导的中性粒细胞化学引诱剂（CINC）等炎性趋化因子，加重肝损伤时的炎症反应[5]。HSC的这种自分泌功能可能是其持续激活或纤维化持续进行的一个十分重要的因素。

　　（二）参与HSC激活的主要细胞因子的作用及其信号传导途径

　　在肝损伤后上述肝固有细胞和浸润的炎症细胞、血小板通过旁分泌或自泌途径的众多细胞因子中，以PDGF和TGF－β1最重要，其中前者是目前已知的最强的促HSC增殖因子，后者是最强的促HSC纤维生成因子。

　　1．PDGF：是HSC的强裂有丝分裂原。此外也促HSC移行，促HSC释放vit A，并可诱导HSC合成TGF、IGF－1和CSF－1等细胞因子。PDGF是由A、B两条多肽链通过二硫键连接组成的二聚体，有PDGF－AA、BB、AB三种异构体。其受体由α、β两个亚单位组成，表现为αα、ββ、αβ三种。PDGF的B链可与α、β两个亚单位结合，而A链只能与α亚单位结合，即PDGF－BB可与αα、ββ、αβ的任何一种结合，PDGF－AA则只能与αα结合。静息的HSC可表达α亚单位，β亚单位仅在HSC受激活刺激后才开始表达，并可被TGF－β1上调。

　　PDGF与HSC上的相应受体结合后，至少可通过两条信号转导途径发挥作用：(1)Ras/细胞外信号调节激酶(ERK)途径：受体细胞内区的酪氨酸激酶激活后，依次激活Ras、Raf-1、MEK和ERK（属有丝分裂原活化蛋白激酶家族），使E1K－1和SAP等转录因子磷酸化而促HSC增殖。若用药物（如提高细胞内cAMP水平）干扰ERK激活，可减弱PDGF对HSC的促增殖作用；(2)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)途径：酪氨酸激酶激活后，可激活PI3-K，其下游的信号转导物质虽尚不十分清楚，但至少可通过蛋白激酶C、核糖体S6激酶和蛋白激酶B等促进HSC增殖和移行。PI3-K的激活也可使Ras/ERK途径激活起作用。用Wortmanin特异抑制PI3-K活性，可对HSC的增殖和移行有呈剂量依赖的抑制效应。PDGF的三种异构体均可激活PI3－K，但以BB作用最强，且既能促进HSC增殖又可促进HSC移行，而AA仅可促HSC增殖，这提示PDGF受体的α、β亚单位的信号转导途径存在着某些差别[6]。除上述两条途径外，激活转录因子信号转导及转录活化蛋白(STARs)的信号途径亦可能参与PDGF发挥作用。STATs以无活性形式仅位于胞浆内，可经酪氨酸或丝氨酸磷酸化激活，激活的STATs转位至胞核并与DNA调控元件结合，调节多种基因转录。PDGF可使HSC的STAT－1激活。

　　PDGF对HSC的促增殖作用，尚依赖细胞内适当的Ca2+浓度和pH。研究表明，PDGF可开放HSC的T型钙通道（即低电压激活钙通道），使细胞外Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度升高；PDGF也增强HSC Na+/H+交换泵（细胞外Na+与细胞内H+交换）活力，提高细胞内pH。用氯化镍阻断T型钙通道或用氨氯吡嗪脒抑制Na+/H+交换泵活性，均可抑制PDGF的促有丝分裂作用，提示适当的细胞内Ca2+浓度和pH为特异性信号转录途径的信号的正确转导所必需，也提示T型钙通道阻断剂或Na+/H+交换泵抑制剂有可能成为抗肝纤维化的有效药物。

　　2．TGF－β1：具有强烈促HSC ECM合成的作用，并通过抑制MMPs合成、促进TIMPs及PAI－1生成而抑制ECM降解。细胞初分泌的TGF－β1多需经水解切除无活性相关肽后才能发挥生物学效应（由无活性形式→活性形式）。其受体有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，通过Ⅰ型受体促进ECM合成，通过Ⅱ型受体抑制细胞增殖，其中Ⅰ型受体的激活依赖Ⅱ型，若缺乏Ⅱ型受体，细胞对TGF－β1则无信号转导。Ⅲ型受体即β聚糖，无信号转导功能。静息状态物HSC仅表达Ⅱ、Ⅲ型，而激活的HSC三型受体均有表达，且随HSC的激活，Ⅰ型增多，Ⅱ型减少，这种量的变化可能更有利于其产生ECM，同时使TGF－β1的增殖抑制作用减弱（由于可刺激HSC产生PDGF，上调PDGF受体β亚单位，反能促进HSC增殖）。

　　TGF－β1须先与II型受体结合，使II型受体激酶端转磷酸，继而激活I型受体激酶。I型受体可激活Ras/ERK途径，作用于转录因子Sp-1、NF-1而增强前胶原α1(Ⅰ)基因转录。I型受体激酶也可激活Smad2、Smad3（为受体激活的Smad亚类成员），后者与Smad4结合成异二聚体并转位至胞核，从而调节ECM等基因的转录，但该途径在HSC中的作用至今尚未见报道[7]。最近，有人用能表达缺失的(tuencated) TGF－β型受体的腺病毒载体在受体水平特异阻断TGF－β的信号转导途径，可显著减轻肝纤维化，改善肝功能[8]，提示TGF－β及其信号转导途径在肝纤维化发生机制中起着关键作用。

　　（三）ECM与HSC的相互作用

　　肝窦Disse间隙的正常基质成份对于维持HSC及其它肝固有细胞的正常功能有着十分重要作用。肝损伤后，Disse间隙微环境发生变化导致细胞表型改变：间质性基质增多激活周围HSC；Ⅳ型胶原的降解产物激活HSC；窦内皮细胞分泌细胞型纤连蛋白，后者激活HSC。此外，ECM作为细胞因子的贮存器，可贮存PDGF、TGF－β1、FGF等细胞因子，参与ECM与细胞的相互作用。

　　ECM与细胞的相互作用可通过整合素(Integrins)介导。整合素是一种膜受体，由α、β亚单位组成（前者至少有15种异构体，后者至少8种，两者共同构成至少21种不同的受体亚型）。其配体为基质分子而非细胞因子，能设别、粘附基质分子如胶原、糖蛋白分子上的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）三肽序列，从而将信号转入细胞，调节细胞增殖、粘附和移行。目前已发现HSC有α1β1、α2β1、αvβ1和α6β4等多种整合素，其中α1β1是Ⅰ、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白相互作用，但结合的亲和力不同。ECM通过整合素作用于细胞的信号转导途径尚不十分明了，局部粘附激酶（FAK）可能起着核心作用，该酶激活依赖整合素的β亚单位，也介导整合素诱导的PI3－K的激活。FAK还可被某些生长因子和神经肽如蛙皮素(bombesin)、血管加压素激活，表明生长因子可与整合素起协同作用[6]。

　　除整合素外，盘状区受体(discoidin domain receptors, DDR)，一种新的受体酪氨酸激酶，能介导纤维性胶原对细胞的作用。研究发现，激活的HSC有DDR mRNA表达[11]，提示成纤维性胶原的积聚可通过DDR激活HSC。

　　（四）其它

　　活性氧可激活HSC、促进ECM合成，且可进一步损伤肝细胞形成恶性循环；脂质过氧化产物丙二醛能促进HSC合成胶原，而抗氧化剂如vit E可减轻肝纤维化程度。在乙醇性肝病，乙醇代谢产生的乙醛和积聚的乳酸以及乙醇诱导的脂质过氧化产物均促进HSC合成胶原。在Wilson病和血色病，铜和铁均为自由剂反应的催化剂，可损伤肝细胞、促进纤维化。HSC的激活伴随胞浆vit A脂滴的丢失，但后者是否为HSC激活所必需尚不清楚。在已激活的HSC的培养基中加入视黄醇或视黄酸，可抑制HSC增殖、胶原合成和TGF－β1表达，这至少说明vit A的丢失可增强HSC增殖与合成的活力[4]。

　　四、ECM的降解异常

　　肝纤维化时，肝内过量积聚的ECM除因HSC激活大量产生外，尚存在降解异常。在ECM降解的调节中，HSC亦起着关键作用[3]。

　　ECM的降解酶主要是MMPs，已至少有21种MMP被克隆、测序及生化特性鉴定。肝内MMP至今发现有7种，可分为四类：(1)胶原酶类，降解纤维性间质胶原包括Ⅰ、Ⅲ型胶原；(2)明胶原酶类，降解变性胶原即明胶，也降解基底膜胶原(IV型)；(3)基质溶解素类，降解蛋白聚糖、层粘连蛋白及其它多种蛋白；(4)膜型MMPs如膜型1-MMP(MT1-MMP)，参与细胞表面蛋白水解事件包括明胶酶原A的激活。MMP的细胞外活性受性精密调控，一方面其酶原转化为有活性的酶可被调控，另一方面其酶活性可被某些特异或非特异性物质（α2－巨球蛋白）所抑制。TIMPs为MMPs的特异性抑制物，可与MMPs催化位点结合发挥抑制作用。目前已发现TIMPs有四个成员即TIMP-1,TIMP-2,TIMP-3及TIMP-4，其中以TIMP-1,TIMP-2研究较深入，前者主要抑制间质胶原酶（人MMP－1，鼠TIMP－13）和基质溶解素、明胶酶B（MMP－9）活性；后者主要抑制明胶酶A（MMP－2）活性，也可与明胶酶原A结合，抑制其激活。

　　肝脏多种细胞均参与调节ECM的降解。研究发明，HSC可产生某些MMP如明胶酶A、间质胶原酶、基质溶解素－1（MMP－3）及MT1－MMP，亦可表达TIMP；Kupffer细胞可产生明胶酶B和少量明胶酶A，也可能合成间质胶原酶；肝细胞虽不能产生MMPs，但可能可通过MT－MMP家族的某一成员参与明胶原A的激活，此外，在肝损伤急性期尚可产生TIMP。

　　在正常情况下，ECM的降解与合成处于动态平衡状态，肝受损时，ECM降解则发生异常。肝损伤早期，明胶酶A及其酶原激活剂MT－MMP表达增加，可降解IV型胶原等ECM成份，改变ECM与细胞的相互作用，导致其周围HSC激活产生大量ECM。随肝纤维化进展，间质胶原酶的基因表达虽无或极少发生变化，但其活性却显著降低，从而使间质性胶原降解减少并大量沉积。间质胶原酶活性降低主要与TIMP对其抑制有关。体外培养的HSC早期（3天内）可有间质胶原酶表达，但无TIMP－1或TIMP－2，随HSC激活，TIMP－1或TIMP－2表达明显增加，间质胶原酶活性则不能测出，若用亲和层析法分离TIMP后，间质胶原酶活性可增加20倍以上。进一步研究表明，肝内TIMP表达也确有增加，人纤维化肝TIMP－1 mRNA及其蛋白较正常肝增加5倍；在CCl4或胆管结扎所致大鼠肝损伤模型上，肝TIMP－1 mRNA在损伤后6小时内即上调，72小时达高峰，此后持续高表达；TIMP－2亦与TIMP－1有相似的变化[3]。最近，有人在大鼠肝纤维化自发逆转模型上发现，纤维化的逆转伴随TIMP－1和TIMP－2表达的迅速下降，间质胶原酶的mRNA表达无变化，而其活性显著增加[12]，表明TIMP降低可提高MMP活性，使ECM降解重建。此外，国内最近也有文献报道将间质胶原酶表达载体导入纤维化大鼠肝内，其逆转纤维化的作用有限，提示MMP活性的抑制物TIMP可能在肝纤维化发生机制中的作用更为重要，也提示设法抑制TIMP表达可能可减轻或逆转肝纤维化。

　　五、HSC的凋亡

　　细胞增殖与凋亡(apoptosis)是细胞生物学的两大主题，增殖增加或／和凋亡减少均可致该细胞积聚。肝纤维化时，HSC数量显著增多，主要原因固然为其激活、增殖所致，但其凋亡的相对不足可能是重要因素。现已有实验表明，静息状态的HSC未见凋亡发生，但随HSC的激活，出现CD95(APO-1/Fas)、CD95L(APO-1/Fas-ligand)的表达和细胞凋亡，在完全激活的HSC中凋亡率达18%[13]。在大鼠CCl4急性肝损伤或肝纤维化模型上，也证实激活的HSC可发生凋亡。而细胞因子TGF－β、TNF－α可抑制其自发或由CD95激动抗体诱发的凋亡，其中TGF－β使自发调亡的发生率降低53%，使由CD95激动抗体诱发的凋亡率从96％降至51％，两者联合应用的抑制作用则更强，由于纤维化肝内TGF－β、TNF－α过表达，因此它们可能是激活的HSC凋亡不足或存活时间延长的重要原因[14]。此外，某些促增殖因子如PDGF、ET－1对HSC凋亡亦有抑制作用。在大鼠肝纤维化自发逆转模型上，当停止CCl4刺激后，激活的HSC可通过凋亡被清除，使HSC数量减少（也因HSC激活、增殖减少），纤维化得以逆转（HSC数量减少可减少ECM合成，也减少TIMP产生，提高MMP活性，促进ECM降解）[12]。上述结果提示，HSC凋亡在肝纤维化发生机制中有重要作用；诱导或促进激活的HSC凋亡可避免或减少HSC聚积，这也可能成为抗肝纤维化治疗的重要对策。

　　小 结

　　肝纤维化是一复杂的动态过程，HSC的激活、增殖与凋亡、ECM的合成与降解失衡最终导致ECM尤其Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝内过量沉积。在此过程中，HSC激活是关键性事件，激活的HSC不仅产生大量ECM，并且通过释放TIMPs抑制MMPs活性而抑制ECM降解。HSC的激活主要是由细胞、ECM与细胞相互作用的结果，有多种细胞因子介导其激活过程，其中以PDGF、TGF－β1最重要，前者是最强的促增殖因子，后者是最强的促纤维生成因子。

　　对肝纤维化发生、发展的分子细胞机制目前虽已取得了较大进展，但有许多问题尚不十分明了，如启动HSC激活的关键基因：vit A丢失与HSC激活的关系；细胞因子在体内的网络调节，一些重要细胞因子的信号转导途径；启动或阻滞HSC凋亡的机制以及宿主免疫表型对纤维化反应的影响等。上述问题的进一步阐明，必将有助于认识肝纤维化的发生机制，且可能为抗肝纤维化治疗提供新的途径，从而为最终使肝纤维化得以延缓或逆转带来希望。