专家视点：HBV基因耐药变异研究进展

　　专家视点：HBV基因耐药变异研究进展

　　作者 南京市解放军第81医院全军肝病中心 常静霞 汪茂荣

　　乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而导致治疗的失败。近年来关于HBV基因耐药变异的机制研究很多，本文对其研究进展综述如下。

　　一、耐药的定义和病毒学基础

　　HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。常用的概念有原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。通常以抑制病毒复制率达50％以上所需的药物浓度(IC50)评估其敏感性；交叉耐药：对一种NA耐药的HBV变异对其他一种或多种NA也具有耐药性。

　　HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，是部分双链环状DNA结构。HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框(open reading frame，ORF)，分别为S基因区、C基因区、P基因区和x基因区。产物为含末端蛋白、间隔区、逆转录酶区RNA酶H区4部分的HBV聚合酶。HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA—DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA—RNA—DNA的复制过程。在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，发生变异的频率为每年(1.4～3.2)X105核苷酸替换／位点。HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别。因此，每一个患者体内的病毒都是由存在基因序列差异的病毒株组成的动态变化的病毒群，即HBV以准种(quasispecies)的形式存在。

　　NA主要通过抑制HBV聚合酶的逆转录酶区活性，阻止HBV复制过程中以HBV的前基因组RNA为模板逆转录生成新的病毒DNA，从而发挥抑制病毒复制的作用，HBV前基因组RNA是以HBV的cccDNA为模板合成的，即NA的药效靶点在cccDNA的下游，所以NA不能直接清除已经存在的cccDNA。为了持续抑制HBV的复制，NA抗HBV治疗的疗程往往需要数年。但在长期应用某一抗病毒药物的情况下，产生选择压力，野生株被抑制。生存下来的突变株占主导，此种药物便失去了疗效，从而导致耐药的发生。

　　所有NA耐药基因突变位点都位于HBV聚合酶逆转录酶区(P区)，目前已统一耐药基因突变位点的定位命名，即从逆转录酶区的上游第一个氨基酸为起点，以rtl～rt344来定位和命名与NA抗病毒药物有关的基因变异位点。其中又再分为A、B、C、D、E、G等亚区，目前已知常见的耐药突变位点主要见于逆转录酶区的A、B、C、D区。

　　二、HBV对NA的耐药分析

　　(一)拉米夫定(LAM) LAM属于L-构型核苷，是目前用于临床最广、时间最长的药物，其产生的耐药也是最多的。在LAM初次治疗时，1、2、3、4和5年YMDD突变的发生率约为23％、46％、55％、65％和7l％。LAM主要的耐药突变位点是rtM204V／I(YMDD变异)，rtM204V变异通常与其补偿突变rtL180M联合出现，rtM204V／I株较野生株复制能力低，而rtL180M的出现使突变株HBV的复制接近野生株的水平圈。目前报道发现的与LAM相关的主要耐药突变有rtM204V、rtM204I和rtL180M，其他的突变位点有rtL80V／I、rtI169T、rtV173L、rtTI84S和rtQ215S这些突变通常以下面不同的组合方式出：(1)trM204I／V+rtIJ80M：(2)rtM204I：(3)rtM204V+rtL1810M+rtV173L：(4)rtM204I+rtI80I：(5)rtM204I／V4+rtQ215S±rtL180M：(6)rtM204V+rtL180M+rtV173L+rtl169T；(7)rtA181T：(8)rtM204I／V+rtT184S±rtL180M：(9)rtM204S+rtLl80M。这些HBV耐药突变株常以准种的形式存在，当使用LAM治疗后，突变株便可成为主要病毒侏。

　　LAM耐药的分子机制目前推断可能是rtM204位点参与形成了LAM与聚合酶的结合部位，rtM204位点发生突变后主要产生了两方面影响：(1)使dNTP结合位点甲基化，从而产生空间位阻降低了LAM与dNTP底物的亲和力；(2)降低使LAM三磷酸根结合到正在复制的病毒DNA的催化活性，这些原导因致rtM204位点突变株的复制力减低，且与LAM的结合力低于野生侏，从而降低了LAM的抗病毒作用。

　　(二)阿德福韦酯(ADV) ADV属于无环嘌呤类核苷酸类似物。与LAM相比，在使用ADV初次治疗时，1～5年基因耐药变异的概率分别为0％、3％、6％、18％、29％，耐药发生的时间和机率都远低于LAM。然而，在已产生了LAM耐药的患者中，单独改用ADV治疗1年和2年，基因耐药变异率分别升高为6.4％和25.4％，ADV联合LAM治疗可降低耐药突变发生率，对于产生LAM耐药的患者，加用ADV为首选。

　　与LAM单点突变不同，ADV相关的耐药突变多为多点突变，目前得到学界公认的主要耐药位点有rtA181T、rtA181V和rtN236T，组合方式主要有四种：(1)rtA181V；(2)rtN236T；(3)rtAl81V+rtN236T；(4)rtA181T+rtN236T。另外rtA181T突变也在长期使用LAM患者的HBV基因中检测到，但是，该突变并未合并rtM204I／V的突变。有认为这是因为rtAl81V／T突变能改变rtM204密码子的位置，导致一个间接的催化位点空间位阻，从而使LAM的敏感性下降。有进一步研究表明A181V／T突变株对LAM、LdT和ETV的敏感性都下降，但对TDF仍然敏感。

　　(三)恩替卡韦(ETV) ETV是一种脱氧嘌呤核苷酸类似物，ETV对初治患者很少发生耐药，1-5年的累积耐药发生率分别为0.2％、0.5％、1.2％、1.2％与1.2％。但对原有LAM耐药的患者，改用ETV，治疗1-5年后的临床耐药率分别为6％～7％、15％～16％、36％、46％和51％。因此，ETV在LAM失效患者中的耐药发生率明显增加，产生LAM耐药的患者不推荐首选ETV。这是因为ETV的耐药变异需要在rtM204+rtL180位突变的基础上，再联合rtT184、rtS202、rtM250和rtI169位点上一个或多个的氨基酸突变。

　　其耐药变异主要有两种模式：(1)rtM250v+rtIl69T+M204v+L18OM；(2) rtT184G+rtS202I+rtM204V+rtL180M。有体外试验证实，rtM250位点突变可引起ETV的敏感性下降，单独rtI169位点的突变对ETV只低度耐药，但rtI169联合rtM250位点突变则可阻止DNA链延伸，从而降低ETV敏感性；rtT184和rtS202位点的突变可以改变YMDD附近的核苷酸聚合酶结合袋的几何构像，影响C区的两个催化性天门冬氨酸残基的编码，从而导致对药物的敏感性下降。ETV需多个位点的突变才能出现耐药，表明它的高基因屏障。由于ETV抗病毒治疗的有效性及低耐药性，被推荐为乙肝肝硬化失代偿期的一线用药。

　　(四)替比夫定(LdT) LdT与LAM同属于L-构型核苷，与LAM耐药基序相似，都发生在YMDD区，但其耐药发生率低于LAM，对初治患者的第l与第2年累积耐药发生率分别为4％与22％。而且LdT出现的耐药突变位点仅有rtM204I，尚未发现rtM204V变异。原因尚不清楚，有研究认为可能与其抗病毒复制的高效能有关。也有文献报道LdT相关的耐药突变还可发生在rtL80、rtL180、rtL181、rtL229等位点，其意义还有待进一步明确。

　　(五)替诺福韦(TDF) TDF是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，国外已批准该药用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)和成人的慢性乙型肝炎。在Ⅲ期临床实验中，替诺福韦治疗2年以上还未被证实有基因型耐药发生，但是此临床实验在治疗72周时对血清仍能检测到病毒者都增加使用了恩曲他滨，所以不能确定72周后单一使用替诺福韦治疗的耐药发生率。有报道称rtA194T变异与TDF耐药相关，能够改变DNA模板与dNTP底物的结合位点，从而影响DNA合成。体外实验发现，rtA181／T或rtN236T突变的ADV耐药株对TDF的敏感性下降34倍；若此位点与rtL180M+rtM204V联合出现，则能增加TDF半数抑制浓度10倍以上。

　　二、HBV基因变异主要的检测方法

　　对于核苷酸类似物耐药的检测，欧美国家多采用IN—NO—LIPA方法，其灵敏度和特异性都比较高，但试剂盒非常昂贵，在我国尚难推广普及。目前国内检测HBV基因耐药变异的方法主要有以下几种，各有其优缺点。下面将逐一阐述。

　　(一)聚合酶链反应一逆向点杂交(PCR—RBD)技术 利用PCR—RBD技术可实现一次检出10余种至几十种突变位点。首先设计带标记的靶序列扩增引物和检测各种耐药突变位点的特异性探针，将各探针固化在尼龙膜上，制成能够检测所有耐药相关SNP突变位点和类型的检测膜条；然后用PCR对检测区域的HBVDNA片段进行扩增，并将扩增产物与检测膜条进行杂交，通过加入四甲基联苯胺进行显色，便可直接判断有无基因耐药突变和突变的类型等结果。刘彦辰等利用该技术建立了LAM、ADV、ETV3种NA药物相关的10个耐药位点上的突变检测，检测结果与直接测序法一致。

　　(二)聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR—RFLP) 用特异性引物PCR扩增目的DNA，再用限制性内切酶消化切割扩增产物，然后通过凝胶电泳分辨不同HBV突变类型产生的由不同片段长度构成的多态性来判断有无基因耐药变异。该方法较简便，具有一定的敏感性和特异性，可检测数量占HBV准种池5％的耐药变异株；曾被国内外众多实验室应用于LAM耐药变异的检测工作中，近来国内也建立了基于该技术的ADV耐药变异检测方法。但所需的限制性内切酶类型较多，有些耐药突变很难找到合适的限制性内切酶。因此，可检测的突变类型有限，对于少数耐药变异位点监测不失为一种简便、快速且廉价的方法。但随着多种NA的相继问世和HBV耐药变异位点的不断出现，该方法将难以胜任多位点变异的检测。

　　(三)基因芯片(gene chip)技术 亦称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray)技术，其基本原理与RBD技术相似，是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列、固定在玻璃或膜等载体上，然后与待测有标记的样品核酸按碱基配对的原则杂交，然后检测结果。不同之处在于基因芯片技术往往使用荧光标记来代替酶标记，将酶催化的化学显色改为荧光扫描观察，通量更高，可实现高达成千上万种SNP的检测。具有快速、高效、敏感、平行化和自动化等优点，可检测已知变异位点。另外随着基因芯片高通量测序技术的进展，还可用于检测未知变异位点。目前国内用于核苷(酸)类似物耐药临床检测的芯片正在研发中。

　　(四)限制性片段质谱多态性技术(RFMP) 该技术将PCR—RFLP技术与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI—TOFMS)技术结合，是根据被测物质的相对分子质量进行定量检测的，在PCR—RFLP的基础上，将消化后的片段与芯片结合，当加入能量吸收分子后，芯片上保留的被测物质形成晶体，在特异的激光照射后，晶体发生解离作用，带电分子在通过电场时加速，记录仪记录飞行时间的长短，质量越轻，相对所带的电荷越多，飞行时间越短。该方法敏感、准确、重复性好，能够发现数量不足HBV准种池1％的变异株，有研究报道用此法检测rtI169、rtT184、rtS202、rtM204、rtM250位点变异。但其同样仅能检测已知位点变异，且价格昂贵，很难在临床推广应用。

　　(五)实时PCR(real—time PCR) 该技术是在PCR反应体系中加人带有荧光基团的突变位点检测探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程的每一个循环，最后通过Ct值和标准曲线对样品中DNA的起始浓度进行定量的方法。该方法操作简便，可检测变异发生率低于10％的耐药变异。缺点为仅能检测已知位点，同样难以实现一次进行多个耐药突变位点的检测；同时，针对每个位点的不同变异均需合成相应的探针。随着NA耐药位点的增多，相应合成探针的费用增高。国内已有经SFDA批准的实时PCR试剂盒用于rtM204V／I变异的临床检测。

　　(六)PCR产物直接测序(direct PCR sequencing) 可进一步分为双脱氧测序法与焦磷酸测序法。是将HBV基因组的逆转录酶区进行扩增后直接进行测序分析的方法。PCR产物直接测序法可检测已知和可能的未知耐药变异位点，是最常用的基因型耐药检测方法之一。Keeffe等认为PCR产物直接测序的方法应作为基因型耐药检测的金标准。该方法的缺点是灵敏度较差，只有当变异株超过HBV准种池(quasispecies pool)的20％时才能被发现。孙树梅等新近报道发现巢式PCR+焦磷酸测序的方法较普通测序法有更好的灵敏性，尤其在低病毒拷贝数时差异明显。这尚有待于临床应用的验证。

　　随着核苷类抗病毒药物的长期广泛应用，其耐药已成为一个不容忽视且广泛关注的问题。目前报道了核苷类药物的一部分耐药的位点，但新的基耐药突变化点不断被发然而，目前应用于临床的、可全面反映基因耐药情况、有效指导临床药物选择的检测方法十分有限。因此，在现有HBV基因耐药突变研究的基础上，建立起适合临床的全面检测HBV耐药突变的新技术，制定更加合理的抗病毒治疗方案，对可能耐药的患者进行相关的耐药方面的检测，及时调整治疗方案，无疑具有非常重要的临床意义。

　　实用肝脏病杂志 2013年10月第16卷第5期